荧光分光光度法课件

吸收吸收发射发射第十一章第十一章 荧光分析法荧光分析法1、光致发光现象、光致发光现象:激发态电子回到低能级而伴随光的辐射激发态电子回到低能级而伴随光的辐射11.1 概述概述热辐射热辐射光辐射光辐射h h+基态基态 激发态激发态 基态基态吸收发射第十一章吸收发射第十一章 荧光分析法荧光分析法1、光致发光现象、光致发光现象:激发态电子回激发态电子回1磷光磷光荧光荧光分子荧光分子荧光原子荧光原子荧光UV 荧光荧光X-射线荧光射线荧光原子原子 荧光荧光光致发光的分类：光致发光的分类：光光光源光源磷光荧光分子荧光原子荧光磷光荧光分子荧光原子荧光UV 荧光荧光X-射线荧光原子射线荧光原子 22荧光分析法荧光分析法：利用物质的荧光谱线：利用物质的荧光谱线波波长和强度长和强度进行定性定量分析方法进行定性定量分析方法。b选择性好选择性好;但应用不如但应用不如UV广泛广泛3特点特点:a灵敏度比灵敏度比UV高高,检测限检测限10-1010-12g/ml荧光荧光:物质分子在激发态最低振动能级物质分子在激发态最低振动能级返回到基态各振动能级时所发射出的光返回到基态各振动能级时所发射出的光 2荧光分析法：利用物质的荧光谱线波长和强度进行定性定量分析方荧光分析法：利用物质的荧光谱线波长和强度进行定性定量分析方3TLC定性、定量定性、定量4应用应用：物质荧光光度法定性定量物质荧光光度法定性定量作为作为HPLC的检测器的检测器TLC定性、定量定性、定量4应用：应用：411.2 11.2 基本原基本原理理如如:电子跃迁电子跃迁1、分子的能级和电子能级的多重性、分子的能级和电子能级的多重性:激发态激发态*分子能级分子能级=电子能级电子能级+振动能级振动能级+转动能级转动能级基态基态11.2.1 分子荧光光谱的产生分子荧光光谱的产生11.2 基本原理如基本原理如:电子跃迁电子跃迁1、分子的能级和电子能级、分子的能级和电子能级5自旋量子数自旋量子数S:0 0 1多重性多重性M=2S+1:1 1 3状态描述状态描述:单重单重S 单重态单重态S 三重态三重态T自旋量子数自旋量子数S:0 0 6能量能量:E E1 1,1 1 E E2 2,2 2 寿命寿命:10-8秒秒 1秒秒跃迁几率跃迁几率:106 1单重激发态单重激发态 三重激发态三重激发态单重单重S*和三重和三重T*激发态的比较激发态的比较能量能量:E1,1 E2,27S0V4V1V0V3V2（b）(a)(d)（b）V0V0S1*S2*V0V1V1V1V2V2V2V3V3V3V4V4V4(c)(e)T1*(f)e 体系间跨越体系间跨越a 吸收吸收 b 振动弛豫振动弛豫c 内部能量转换内部能量转换d 荧光荧光2、荧光的产生、荧光的产生f 磷光磷光S0V4V1V0V3V2（b）(a)(d)（b）V0V0S18(1)振动弛豫振动弛豫：非辐射热释放非辐射热释放 10-12秒秒(2)内部能量的转移内部能量的转移(3)荧光发射荧光发射特点：荧光的能量小于激发光能量。特点：荧光的能量小于激发光能量。荧光发射所需时间为荧光发射所需时间为10-910-7s。(4)外部能量的转移外部能量的转移(碰撞碰撞 热热)-荧光淬灭荧光淬灭(熄灭熄灭)特点特点:降低荧光强度。降低荧光强度。预防预防:黏度黏度,温度温度(1)振动弛豫：非辐射热释放振动弛豫：非辐射热释放 10-12秒秒(2)内部能量的内部能量的9(5)体系间的跨越体系间的跨越:ST 降低荧光强度降低荧光强度发生条件发生条件(1)结构含有重原子如结构含有重原子如BrBr、I I等等,(2)溶剂中有顺磁性物质如溶剂中有顺磁性物质如O2(6)磷光：经过体系间跨越的分子降至三线态磷光：经过体系间跨越的分子降至三线态最低能级，跃迁至基态而发生的光。最低能级，跃迁至基态而发生的光。基态基态S1*弛豫弛豫跨越跨越T1*T1V=0*基态基态荧光荧光 磷光产生过程磷光产生过程：磷光磷光基态基态S2*弛豫弛豫跨越跨越S S1 1*S S1V=01V=0*基态基态荧光荧光(5)体系间的跨越体系间的跨越:ST 降低荧光强度发生条件降低荧光强度发生条件(1)101.荧光光谱荧光光谱(发射光谱发射光谱):激发波长激发波长ex和和I0强度一定。强度一定。Fem单色器单色器I I0exI I表面吸表面吸光物质光物质单色器单色器检测器检测器em二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱1.荧光光谱荧光光谱(发射光谱发射光谱):激发波长激发波长ex和和I0强度一定。强度一定。F11(1)不同强度的光照射物质所产生的荧光光不同强度的光照射物质所产生的荧光光谱形状是否相同？谱形状是否相同？(2)不同波长的光照射物质所产生的荧光光不同波长的光照射物质所产生的荧光光谱是否相同？谱是否相同？答答:光谱形状相同光谱形状相同,强度强度I0和波长和波长ex影响影响荧光强度荧光强度2、激发光谱：荧光、激发光谱：荧光em不变不变;FeXF(1)不同强度的光照射物质所产生的荧光光谱形状是否相同？答不同强度的光照射物质所产生的荧光光谱形状是否相同？答:12特征特征:(1)stokes位移：位移：emex 说明在激发和发射之间存在一定的能量损失。说明在激发和发射之间存在一定的能量损失。产生原因：振动驰豫、内转换产生原因：振动驰豫、内转换 (2)荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关(4)荧光光谱与激发光谱相似荧光光谱与激发光谱相似-镜像镜像?如如:蒽的光谱和激发蒽的光谱和激发(3)荧光强度与激发光波长有关荧光强度与激发光波长有关特征特征:(1)stokes位移：位移：emex(2)荧光光荧光光13荧光分光光度法课件荧光分光光度法课件141、物质产生荧光的必要条件、物质产生荧光的必要条件A 强吸光结构，共轭强吸光结构，共轭*B 高荧光效率。高荧光效率。荧光效率荧光效率(f)=发射荧光的光子数发射荧光的光子数吸收激发光的光子数吸收激发光的光子数11.2.3荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系1、物质产生荧光的必要条件荧光效率、物质产生荧光的必要条件荧光效率(f)=发射荧光的光子数发射荧光的光子数152、分子结构与荧光效率的关系、分子结构与荧光效率的关系A 长的共轭结构长的共轭结构 例例激发光激发光 205nm 286nm 356nm荧光荧光 278nm 321nm 404nm荧光效率荧光效率 0.11 0.29 0.362、分子结构与荧光效率的关系、分子结构与荧光效率的关系A 长的共轭结构长的共轭结构 例激发光例激发光 16B 分子的刚性和共平面性分子的刚性和共平面性荧光效率荧光效率：0.2 1.08-羟基喹啉羟基喹啉 8-羟基喹啉镁羟基喹啉镁1-二甲氨基萘二甲氨基萘-7-磺酸盐磺酸盐 1-二甲氨基萘二甲氨基萘-8-磺酸盐磺酸盐B 分子的刚性和共平面性荧光效率：分子的刚性和共平面性荧光效率：0.2 17C 取代基取代基：给电子基团使荧光效率增大，给电子基团使荧光效率增大，如如-OH、-OCH3、-NH2等。等。吸电子基团使荧光效率减少，吸电子基团使荧光效率减少，如如-COOH、-NO2、-X。中性基团对荧光效率影响不大。中性基团对荧光效率影响不大。如如-R、NH3+等。等。C 取代基：取代基：1812.2.4 影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素1、溶剂、溶剂 A 溶剂的极性溶剂的极性：极性越大，：极性越大，em增大，荧光效率增大，荧光效率也增强。通常选择极性溶剂。也增强。通常选择极性溶剂。B 粘度粘度：粘度系数越大：粘度系数越大,有利于荧光效率的提高有利于荧光效率的提高2、温度、温度温度温度，碰撞机率，碰撞机率，效率，效率。热淬灭。热淬灭12.2.4 影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素1、溶剂、溶剂 2、温度温度、温度温度 193、pH值：酸度改变了弱酸弱碱的结构，从而值：酸度改变了弱酸弱碱的结构，从而使其荧光效率受到影响。使其荧光效率受到影响。分子状态最强分子状态最强4、荧光熄灭剂：、荧光熄灭剂：OH-H+OH-H+碰撞熄灭碰撞熄灭化学反应淬灭化学反应淬灭 体系间跨越体系间跨越引起荧光熄灭的形式：引起荧光熄灭的形式：自熄灭现象自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生：当荧光物质的浓度升高而产生3、pH值：酸度改变了弱酸弱碱的结构，从而使其荧光效率受到值：酸度改变了弱酸弱碱的结构，从而使其荧光效率受到205、散射光的影响、散射光的影响引起光的散射原因有：比色皿表面，溶液内引起光的散射原因有：比色皿表面，溶液内微粒，溶液内气泡。微粒，溶液内气泡。散射类别散射类别：a 瑞利散射瑞利散射:波长不变波长不变,方向改变方向改变b拉曼散射拉曼散射:波长变化波长变化散射光波长与荧光接近，对荧光强度测定散射光波长与荧光接近，对荧光强度测定有干扰，使其读数增大。有干扰，使其读数增大。5、散射光的影响引起光的散射原因有：比色皿表面，溶液内微粒，、散射光的影响引起光的散射原因有：比色皿表面，溶液内微粒，21荧荧光光光光谱谱散散射射光光谱谱荧光光谱散射光谱荧光光谱散射光谱22溶剂溶剂 ex248313365405436水水271350416469511乙醇乙醇267344409459500环已烷环已烷267344408458499四氯化碳四氯化碳 320375418450氯仿氯仿346410461502不同波长激发光下主要溶剂的不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长拉曼光波长溶剂溶剂 ex248313365405436水水271350423如何提高检测精度如何提高检测精度(1)改善改善散射光因素影响：溶液透明，选择合散射光因素影响：溶液透明，选择合适测定波长。适测定波长。(2)选择合适的选择合适的溶剂溶剂如水。如水。？如何提高检测精度如何提高检测精度(1)改善散射光因素影响：溶液透明，选择合适改善散射光因素影响：溶液透明，选择合适24定量定量I IF溶液的荧光溶液的荧光一般在与激发光源垂直的方向观察荧光一般在与激发光源垂直的方向观察荧光I Io o4.3 定性、定量分析定性、定量分析荧光定性：依据激发光谱和荧光光谱。荧光定性：依据激发光谱和荧光光谱。定量定量IF溶液的荧光一般在与激发光源垂直的方向观察荧光溶液的荧光一般在与激发光源垂直的方向观察荧光Io4.25荧光分光光度法课件荧光分光光度法课件26当当ECl0.05，F C 偏离线性关系偏离线性关系当当ECl0.05时，可得低浓度时，时，可得低浓度时，F C 线性关系。线性关系。27定量分析方法：定量分析方法：1工作曲线法工作曲线法2比例法比例法*标准溶液对仪器校正标准溶液对仪器校正I0方法方法:标准组分的空白液调标准组分的空白液调F0=0;标准硫酸奎宁标准硫酸奎宁液调液调F=50或或100,测定各标准液的测定各标准液的F,以以F为纵坐为纵坐标标,组分浓度组分浓度C为横坐标作图回归直线为横坐标作图回归直线.*如空白液无法调如空白液无法调F0=0,则以则以(Fi-F0)C作图回归作图回归定量分析方法：定量分析方法：1工作曲线法工作曲线法2比例法比例法*标准溶液对仪器校正标准溶液对仪器校正I0281、灵敏度高、灵敏度高(10-910-12):荧光强度的灵敏度取决荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度。于检测器的灵敏度。F与原光强度与原光强度I0有关有关荧光分光光度法特点：荧光分光光度法特点：2、光源要求稳定：氙灯或激光、光源要求稳定：氙灯或激光1、灵敏度高、灵敏度高(10-910-12):荧光强度的灵敏度取决于荧光强度的灵敏度取决于29二、仪器二、仪器分类：滤光片荧光计、滤光片分类：滤光片荧光计、滤光片-单色器荧光计、单色器荧光计、荧光分光光度计荧光分光光度计单色器单色器I I0exI I表面吸表面吸光物质光物质单色器单色器检测器检测器em二、仪器分类：滤光片荧光计、滤光片二、仪器分类：滤光片荧光计、滤光片-单色器荧光计、荧光分光光单色器荧光计、荧光分光光304 应用（在中药）应用（在中药）1、自身发射荧光、自身发射荧光:分离分离检测检测HPLC:荧光检测器荧光检测器TLC:365,254nm激发激发2、荧光淬灭、荧光淬灭:分离分离检测检测 TLC硅胶硅胶GF2544 应用（在中药）应用（在中药）1、自身发射荧光、自身发射荧光:分离分离检测检测HPLC313、制备荧光衍生物、制备荧光衍生物无荧光无荧光有荧光有荧光 淫羊藿苷淫羊藿苷+SLS 荧光检测荧光检测十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠如何创造较强荧光是现代荧光分析研究的方向如何创造较强荧光是现代荧光分析研究的方向3、制备荧光衍生物无荧光有荧光、制备荧光衍生物无荧光有荧光 淫羊藿苷淫羊藿苷+SLS 32不同物质的荧光测定法不同物质的荧光测定法1、自身有荧光的物质直接测定、自身有荧光的物质直接测定多环芳烃多环芳烃/霉菌毒素霉菌毒素/色素和核蛋白色素和核蛋白(卟啉类卟啉类)/生物碱：喹啉类、异喹啉类、吲哚类生物碱：喹啉类、异喹啉类、吲哚类维生素：维生素：A、B2、B6药物：激素、抗菌素、喋啶类、吡啶、药物：激素、抗菌素、喋啶类、吡啶、哌啶类、芳酸芳酯哌啶类、芳酸芳酯不同物质的荧光测定法不同物质的荧光测定法332、较弱荧光物质、较弱荧光物质较弱荧光物质可通过与荧光增强剂反应后，再较弱荧光物质可通过与荧光增强剂反应后，再进行测定。进行测定。(1)荧光增强剂荧光增强剂：防荧光猝灭：防荧光猝灭a.环糊精环糊精(pHC10石蜡烃已烷液、甘油、二甲亚砜、淀粉液、三石蜡烃已烷液、甘油、二甲亚砜、淀粉液、三乙醇胺等。乙醇胺等。d.挥发酸挥发酸(硝酸硝酸,甲酸甲酸,乙酸乙酸,盐酸盐酸);挥发碱挥发碱(氨、二氨、二乙胺、乙二胺乙胺、乙二胺)2、较弱荧光物质、较弱荧光物质343、非荧光物质的荧光衍生化、非荧光物质的荧光衍生化1)荧光衍生化试剂荧光衍生化试剂(条件温和、衍生物稳定、易分离、不具荧光条件温和、衍生物稳定、易分离、不具荧光)丹磺酰氯及类似物丹磺酰氯及类似物：胺、氨基酸、羟基化合物、：胺、氨基酸、羟基化合物、醛酮酸硫醇等的衍生化分离和测定。用荧光增醛酮酸硫醇等的衍生化分离和测定。用荧光增强剂增强与保护。强剂增强与保护。ex350nm、em500nm丹磺肼丹磺肼：醛、酮、还原糖的测定：醛、酮、还原糖的测定 ex350nm、em500nm荧光胺荧光胺：伯胺、氨基酸、肽及潜在伯胺基化合物：伯胺、氨基酸、肽及潜在伯胺基化合物 ex390nm、em475nm手性荧光化试剂手性荧光化试剂：苯托芬：苯托芬BOP-Cl:S-(+)-benoxaprofen-Cl用于伯、仲胺；羟基化合物用于伯、仲胺；羟基化合物3、非荧光物质的荧光衍生化、非荧光物质的荧光衍生化352)环化和缩合反应：增加环化和缩合反应：增加电子体系和分子的电子体系和分子的刚性刚性 投影投影如：邻苯二醛与组胺反应如：邻苯二醛与组胺反应3)氧化还原反应氧化还原反应 如：铁氰化钾如：铁氰化钾-肾上腺素类和多巴胺肾上腺素类和多巴胺 硫胺素硫胺素-碱性介质中氧化碱性介质中氧化 碘氧化甲氢化棕榈碱、四氢黄连碱碘氧化甲氢化棕榈碱、四氢黄连碱 四氢硼钠还原黄曲霉素四氢硼钠还原黄曲霉素B1、B2、G1、G2 二氯化锡还原硝基联苯二酸。二氯化锡还原硝基联苯二酸。2)环化和缩合反应：增加环化和缩合反应：增加电子体系和分子的刚性电子体系和分子的刚性 投影投影36