液相色谱基础知识课件

液相色谱基础知识关于色谱关于色谱色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器仪器常见的分离方式：常见的分离方式：蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤等等等等色谱是其中一种分离工具是其中一种分离工具色谱法简介色谱法简介色谱法（色谱法（ChromatographyChromatography）溯源溯源俄国科学加俄国科学加19031903年发现色谱的吸附原理，开创年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献于俄文的文献19061906年正式命名（见诸文献）年正式命名（见诸文献）色谱法；色谱法；ChromatographyChromatography5050年代开始广泛研究和应用年代开始广泛研究和应用主要是气相色谱及薄层色谱主要是气相色谱及薄层色谱高效液相色谱法的广泛应用始于高效液相色谱法的广泛应用始于7070年代年代色谱的发明人色谱的发明人俄国科学家：俄国科学家：M.S.M.S.TswettTswett正式命名正式命名“色谱色谱”的文献的文献一、色谱起源一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱经典液相色谱经典液相色谱色谱分离的机理色谱分离的机理分离是一个物理的过程流动相（流动相（Mobile Phase）固定相（固定相（Stationary Phase）样品（溶解于流动相中的溶质）样品（溶解于流动相中的溶质）什么是液相色谱什么是液相色谱气相色谱：流动相是气相气相色谱：流动相是气相液相色谱：流动相是液相液相色谱：流动相是液相什么是高效液相色谱什么是高效液相色谱High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法，简称：高效液相色谱法，简称：HPLCHPLC是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器及高灵敏度的检测器广泛应用于各个领域：广泛应用于各个领域：医药医药 /环保环保 /石化石化 /生命科学生命科学 /食品及农业食品及农业在技术，理论及应用上仍处于发展阶段在技术，理论及应用上仍处于发展阶段液相液相色谱的基本流程图色谱的基本流程图流动相 泵色谱柱检测器 泵输液分离 检测 记录AEGBCDF进样阀进样HPLC的仪器配置的仪器配置色谱泵色谱泵色谱泵色谱泵自动进样器自动进样器自动进样器自动进样器色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱检测器检测器检测器检测器数据处理系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统溶剂溶剂溶剂溶剂HPLC的应用的应用在食品研究中的分析应用在食品研究中的分析应用在食品研究中的分析应用在食品研究中的分析应用食品中的天然成分食品中的天然成分食品中的天然成分食品中的天然成分碳水化合物碳水化合物类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇脂肪酸和有机酸脂肪酸和有机酸蛋白、肽、氨基酸蛋白、肽、氨基酸食品添加剂食品添加剂食品添加剂食品添加剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂抗氧化剂、防腐剂颜料和染料（色素颜料和染料（色素维生素维生素污染物污染物污染物污染物霉菌（黄曲霉毒素霉菌（黄曲霉毒素农药和农药和兽药残留兽药残留多环芳烃（多环芳烃（PAHSPAHS和亚硝酸和亚硝酸HPLC的应用的应用在兽药研究中分析应用在兽药研究中分析应用在兽药研究中分析应用在兽药研究中分析应用在医药研究中分析应用在医药研究中分析应用在医药研究中分析应用在医药研究中分析应用 药物分析有药物分析有药物分析有药物分析有USPUSP、BPBP、CPCP等标准等标准等标准等标准常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。血管药、磺胺类消炎药等。血管药、磺胺类消炎药等。血管药、磺胺类消炎药等。甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。激素和孕激素等。激素和孕激素等。激素和孕激素等。抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。四环素、氯霉素、诺氟沙星等。四环素、氯霉素、诺氟沙星等。四环素、氯霉素、诺氟沙星等。中草药研究中的应用：生物碱、甙类中草药研究中的应用：生物碱、甙类中草药研究中的应用：生物碱、甙类中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙皂甙、强心甙、黄酮甙皂甙、强心甙、黄酮甙皂甙、强心甙、黄酮甙等等等等)、萜类、萜类、萜类、萜类手性药物手性药物手性药物手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分研究中的应用：光学异构体的拆分研究中的应用：光学异构体的拆分研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂如解毒剂如解毒剂如解毒剂D-D-青霉青霉青霉青霉胺毒性小，胺毒性小，胺毒性小，胺毒性小，L-L-异构体毒性很强异构体毒性很强异构体毒性很强异构体毒性很强)医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。HPLC 的应用的应用在生物化学和生物工程中的应用在生物化学和生物工程中的应用在生物化学和生物工程中的应用在生物化学和生物工程中的应用氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（儿茶酚胺类生物胺的分析研究（儿茶酚胺类生物胺的分析研究（儿茶酚胺类生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)在精细化工分析中的应用在精细化工分析中的应用在精细化工分析中的应用在精细化工分析中的应用醇、醛和酮、醚的分离分析醇、醛和酮、醚的分离分析醇、醛和酮、醚的分离分析醇、醛和酮、醚的分离分析酸和酯的分离分析酸和酯的分离分析酸和酯的分离分析酸和酯的分离分析表面活性剂的分析表面活性剂的分析表面活性剂的分析表面活性剂的分析聚合物的分析研究聚合物的分析研究聚合物的分析研究聚合物的分析研究药物、农药、染料、炸药等工业产品药物、农药、染料、炸药等工业产品药物、农药、染料、炸药等工业产品药物、农药、染料、炸药等工业产品在无机离子分析中应用在无机离子分析中应用在无机离子分析中应用在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析 HPLC的应用的应用在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要毒品分析等毒品分析等毒品分析等毒品分析等在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测酚类和胺类的检测酚类和胺类的检测酚类和胺类的检测 *2004200420042004年获悉，世界上化合物总数达到年获悉，世界上化合物总数达到年获悉，世界上化合物总数达到年获悉，世界上化合物总数达到4700470047004700万，其中绝大部万，其中绝大部万，其中绝大部万，其中绝大部分是有机化合物，而大约有分是有机化合物，而大约有分是有机化合物，而大约有分是有机化合物，而大约有70707070以上是不挥发的。对以上是不挥发的。对以上是不挥发的。对以上是不挥发的。对HPLCHPLCHPLCHPLC来来来来说，只要被分析物质在流动相溶剂（各种各样中有一定的说，只要被分析物质在流动相溶剂（各种各样中有一定的说，只要被分析物质在流动相溶剂（各种各样中有一定的说，只要被分析物质在流动相溶剂（各种各样中有一定的溶解度便可分析。所以，溶解度便可分析。所以，溶解度便可分析。所以，溶解度便可分析。所以，HPLCHPLCHPLCHPLC在各行各业有着广泛的应用潜在各行各业有着广泛的应用潜在各行各业有着广泛的应用潜在各行各业有着广泛的应用潜力。力。力。力。高效液相色谱基本概念高效液相色谱基本概念色谱图：色谱图：HPLC图形图形结果结果（Chromatogram）色谱图色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。色谱峰色谱峰保留时间（分）保留时间（分）基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语色谱峰色谱峰 PeakPeak色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线曲线峰底峰底 Peak BasePeak Base峰的起点与终点之间连接的直线峰的起点与终点之间连接的直线峰高峰高 Peak HeightPeak Height峰最大值到峰底的距离峰最大值到峰底的距离峰宽峰宽 Peak WidthPeak Width在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半（高）峰宽半（高）峰宽 Peak Width at Half HeightPeak Width at Half Height通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离交两点之间的距离液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语峰面积峰面积 Peak AreaPeak Area峰与峰底之间的面积峰与峰底之间的面积,又称响应值又称响应值标准偏差；标准偏差；Standard Error Standard Error0.6070.607倍峰高处所对应峰宽的一半倍峰高处所对应峰宽的一半拖尾峰拖尾峰 Tailing PeakTailing Peak后沿较前沿平缓的不对称峰后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰前伸峰 Leading PeakLeading Peak前沿较后沿平缓的不对称峰前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰鬼峰 Ghost PeakGhost Peak并非由试样所产生的峰并非由试样所产生的峰；亦称假峰亦称假峰液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语基线基线 BaselineBaseline在正常操作条件下在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的仅由流动相所产生的响应信号的曲线曲线基线飘移基线飘移 Baseline DriftBaseline Drift基线随时间定向的缓慢变化基线随时间定向的缓慢变化基线噪声；基线噪声；N N Baseline Noise Baseline Noise由各种因素所引起的基线波动由各种因素所引起的基线波动谱带扩展谱带扩展 Band BroadeningBand Broadening由于纵向扩散由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响传质阻力等因素的影响,使组分在色谱使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象柱内移动过程中谱带宽度增加的现象液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语死时间，死时间，t t0 0 Dead time Dead time不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间的时间保留时间，保留时间，t tR R Retention time Retention time组分从进样到出现峰最大值所需的时间组分从进样到出现峰最大值所需的时间死体积死体积，V V0 0 Dead volume Dead volume不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积的流动相体积保留体积，保留体积，V VR R Retention volume Retention volume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积液相色谱应用：制备型液相色谱液相色谱应用：制备型液相色谱分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求对分离及纯化的要求化合物的稳定性化合物的稳定性样品的复杂性样品的复杂性制备量的要求制备量的要求纯度的要求，及纯度的鉴定纯度的要求，及纯度的鉴定方法的安全性方法的安全性液相色谱应用：分析型液相色谱液相色谱应用：分析型液相色谱定量分析主要基于与标准品的比较定量分析主要基于与标准品的比较是其最大应用领域是其最大应用领域定性分析；不是色谱的强项定性分析；不是色谱的强项基于样品的保留时间比较基于样品的保留时间比较借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器对定量及定性分析的要求对定量及定性分析的要求灵敏度、精度及准确度的要求灵敏度、精度及准确度的要求样品量的要求；复杂样品的分析能力样品量的要求；复杂样品的分析能力容易使用容易使用液相色谱实验所需的基本参数液相色谱实验所需的基本参数液相色谱实验所需的基本参数液相色谱实验所需的基本参数流动相：种类及配比，等度或梯度流动相：种类及配比，等度或梯度固定相：色谱柱类型及内径、长短固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相输送系统参数：流速流动相输送系统参数：流速检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等温度控制温度控制进样量进样量以上参数即构成一个具体的以上参数即构成一个具体的HPLCHPLC方法；亦称色方法；亦称色谱条件谱条件评价液相色谱方法的标准评价液相色谱方法的标准问题：什么样的分离结果是好的？分离度？灵敏度？什么是色谱的分离度什么是色谱的分离度分离度的公式：R：分离程度的量度影响分离度的因素：影响分离度的因素：K、及及N分离度方程：分离度方程：K K 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱之间作用的强弱 是分离因子，描述两个被分离组份分离的好是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素坏程度，是化学因素 N N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度若若 N 增加增加 2倍倍 或或 3倍倍,R会如何变化会如何变化?分离度方程解析：柱效项分离度方程解析：柱效项N 理论塔板数：分离效率的量度理论塔板数：分离效率的量度PW=.5PW=2色谱柱的柱效色谱柱的柱效 N N理论塔板数计算公式：Ws 方法Wtan16切线法Wh5.54半峰高W3s9 3sW4s16 4sW5s25 5s分离度方程解析：分离因子项分离度方程解析：分离因子项 若若 =1.1 or 1.4，R 会如何变化？会如何变化？分离因子：峰分离程度的量度分离因子：峰分离程度的量度V1 V2V3 V0时间 0.5 1 2 5分离因子：分离因子：定义：定义：a a=1 =1 时两组分分不开，时两组分分不开，改变改变a a的途径的途径 改变固定相或改变流动相改变固定相或改变流动相(组成组成)改变温度改变温度 改变样品的本身性质改变样品的本身性质通过改变流动相组成改变通过改变流动相组成改变，同样强度的不同溶剂同样强度的不同溶剂改变色谱柱改变色谱柱改变分离因子改变分离因子 的例子的例子若若 =1,2,10 or 20,R会如何变化会如何变化?分离度方程解析：容量因子项分离度方程解析：容量因子项K 容量因子：保留能力的量度容量因子：保留能力的量度 V0V1 V2V3时间 0.5 1 2 5 k 值值 k 项项 k 对对分离度影响分离度影响 0 0 0 1 1/2 .50 2 2/3 .67 3 3/4 .75 10 10/11 .91 20 20/21 .95 容量因子容量因子 k 与分离度与分离度的关系的关系与 R 的关系容量因子容量因子 k 与峰高的关系与峰高的关系改变改变 k k 值的方法：值的方法：调节流动相的极性（比例）、调节流动相的极性（比例）、pHpH、离子强度等离子强度等梯度淋洗梯度淋洗改变容量因子改变容量因子 K 的例子的例子谱图、k k 及及 N N 如何控制分离度如何控制分离度对称因子计算示意图 色谱峰的对称性对称因子：a.拖尾因子 b.不对称因子峰对称因子计算公式对称因子(fs)：式中：fs=0.951.05为正常峰 fs0.95为前延峰 fs1.05为拖尾峰液相色谱原理液相色谱原理 更进一步的探讨更进一步的探讨离子型化合物的分离方式离子型化合物的分离方式多数化合物是离子型的！多数化合物是离子型的！使用离子交换柱：离子交换法使用离子交换柱：离子交换法主要用于主要用于“强强”阴、阳离子阴、阳离子使用反相柱使用反相柱离子抑制色谱法：通过改变流动相的离子抑制色谱法：通过改变流动相的pHpH值，使值，使样品成中性样品成中性离子对色谱法：加入离子对色谱法：加入“对离子对离子”，使样品呈中，使样品呈中性性离子抑制色谱离子抑制色谱离子型化合物在反相色谱柱上不保留离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的改变流动相的pHpH值，抑制样品离子的电离值，抑制样品离子的电离主要适用于弱酸性化合物的分离主要适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的降低流动相的pHpH值，使样品降低离子化值，使样品降低离子化使用硅胶基质使用硅胶基质C C1818填料填料使用条件应在填料基质的范围内使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的硅胶柱的pHpH在在2-82-8（较保险值（较保险值3-73-7）内）内离子抑制色谱实例离子抑制色谱实例而而 在在 乙乙 腈腈/水水 并并 且且pH=7pH=7时时，多多数数组组份份保保留留时时间间很很短短，无无法完全分离。法完全分离。离子抑制色谱的使用范围离子抑制色谱的使用范围下列情况下不能使用离子抑制方法，如果：下列情况下不能使用离子抑制方法，如果：一些酸在一些酸在pHpH低于低于2 2时还保持离子化时还保持离子化一些碱在一些碱在pHpH高于高于7 7时还保持离子化时还保持离子化可以有以下的选择可以有以下的选择离子交换色谱离子交换色谱使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在pHpH高于高于7 7时用离子抑制法时用离子抑制法使用使用“离子对色谱法离子对色谱法”离子对色谱法离子对色谱法在反相色谱流动相内加入在反相色谱流动相内加入“离子对离子对”试剂试剂与样品中可电离的组份形成与样品中可电离的组份形成“对离子对离子”在反相色谱柱上分离离子型化合物在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型离子对试剂的类型季铵盐、叔胺盐季铵盐、叔胺盐 （正离子），适用于弱酸（正离子），适用于弱酸烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱碱碱烷基长度不同，形成对离子的能力不同 抗组胺及减充血剂药物的分析抗组胺及减充血剂药物的分析离子对色谱的应用离子对色谱的应用离子对色谱分析水溶性维生素离子对色谱分析水溶性维生素