液即分配色谱法课件

层析技术概述因其操作简便、高分辨率、高灵敏度、选择性好、样品量少、结果准确等特点适合于标本含量少,杂质含量多样品分析尤其适用于生物样品的分离分析层析技术成为已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法，是生命科学、医学实验技术等研究领域必不可少的手段和工具。二、层析技术二、层析技术发展史发展史发展史发展史19031903年，俄国植物学家茨维特年，俄国植物学家茨维特-将碳酸钙装入玻璃管内，成为柱形将碳酸钙装入玻璃管内，成为柱形将碳酸钙装入玻璃管内，成为柱形将碳酸钙装入玻璃管内，成为柱形-抽提植物叶子得色素溶液，通过碳酸钙抽提植物叶子得色素溶液，通过碳酸钙抽提植物叶子得色素溶液，通过碳酸钙抽提植物叶子得色素溶液，通过碳酸钙柱柱柱柱-石油醚洗涤柱子上石油醚洗涤柱子上石油醚洗涤柱子上石油醚洗涤柱子上下：叶绿素下：叶绿素下：叶绿素下：叶绿素b,a,b,a,b,a,b,a,叶黄素，胡萝卜素叶黄素，胡萝卜素叶黄素，胡萝卜素叶黄素，胡萝卜素-混合物的不同组分得到了分离混合物的不同组分得到了分离混合物的不同组分得到了分离混合物的不同组分得到了分离-得到的色带称为色谱，方法命名为色谱法得到的色带称为色谱，方法命名为色谱法得到的色带称为色谱，方法命名为色谱法得到的色带称为色谱，方法命名为色谱法层析法进行时有两个相层析法进行时有两个相 固定相固定相（支持物支持物），流动相流动相（含待分离物质含待分离物质）。固定相固定相固定相固定相-碳酸钙碳酸钙碳酸钙碳酸钙流动相流动相流动相流动相-石油醚石油醚石油醚石油醚Michael Tswett(1872-Michael Tswett(1872-1919),the inventor of the 1919),the inventor of the method of column method of column chromatography chromatography 这是利用色谱法探究生命的启蒙和开端这是利用色谱法探究生命的启蒙和开端这是利用色谱法探究生命的启蒙和开端这是利用色谱法探究生命的启蒙和开端,之之之之后后后后20202020多年，无人关注这一伟大发明多年，无人关注这一伟大发明多年，无人关注这一伟大发明多年，无人关注这一伟大发明1931193119311931年，德国库恩重复茨维特实验，并分离年，德国库恩重复茨维特实验，并分离年，德国库恩重复茨维特实验，并分离年，德国库恩重复茨维特实验，并分离60606060多种色素多种色素多种色素多种色素1938193819381938年，从年，从年，从年，从VBVBVBVB中分离中分离中分离中分离B6,B6,B6,B6,出色的研究获得出色的研究获得出色的研究获得出色的研究获得1938193819381938年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖1941194119411941年，英国生物化学家马丁发展了色谱技术，发现了液年，英国生物化学家马丁发展了色谱技术，发现了液年，英国生物化学家马丁发展了色谱技术，发现了液年，英国生物化学家马丁发展了色谱技术，发现了液-液液液液即分配色谱法即分配色谱法即分配色谱法即分配色谱法-预测并实现气相色谱技术，预测并实现气相色谱技术，预测并实现气相色谱技术，预测并实现气相色谱技术，1952195219521952年将色谱技术原理应用到分离年将色谱技术原理应用到分离年将色谱技术原理应用到分离年将色谱技术原理应用到分离气体上，混合气体通过后，在另一端出现时得以分离气体上，混合气体通过后，在另一端出现时得以分离气体上，混合气体通过后，在另一端出现时得以分离气体上，混合气体通过后，在另一端出现时得以分离-20-20-20-20世纪世纪世纪世纪60606060年代，普通色年代，普通色年代，普通色年代，普通色谱法已经不能满足人们对谱法已经不能满足人们对谱法已经不能满足人们对谱法已经不能满足人们对生物成分分析测试的要求生物成分分析测试的要求生物成分分析测试的要求生物成分分析测试的要求-高效液相色谱，高效液相色谱，高效液相色谱，高效液相色谱，high high high high performance liquid performance liquid performance liquid performance liquid chromatographychromatographychromatographychromatography即即即即HPLCHPLCHPLCHPLC特别适用于高沸点、特别适用于高沸点、特别适用于高沸点、特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性不能气化或热稳定性不能气化或热稳定性不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，差的有机物分离分析，差的有机物分离分析，差的有机物分离分析，生物化学与分子生物生物化学与分子生物生物化学与分子生物生物化学与分子生物学中的应用日益广泛。学中的应用日益广泛。学中的应用日益广泛。学中的应用日益广泛。高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法又称高压又称高压又称高压又称高压 高速、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色高速、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色高速、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色高速、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。谱的基础上发展起来的分析技术。谱的基础上发展起来的分析技术。谱的基础上发展起来的分析技术。高压泵、进样装置、色谱柱、检测器高压泵、进样装置、色谱柱、检测器HPLCHPLC的特点的特点1.1.1.1.高压高压高压高压 2.2.2.2.高速高速高速高速 3.3.3.3.高效高效高效高效 4.4.4.4.高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度三、层析技术原理层析系统由两相组成：一是固定相，另一是流动相流动相：携带流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相三、层析技术原理当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，各组分移动速度各异，因而可将各组份分离若分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，最终达到分离各组分的目的。四、层析技术分类吸吸附附层层析析法法柱层析法柱层析法（高高效效液液相相层层析）析）层层 析析法法气相层析法超超临临界界层层析析法法液相层析液相层析薄薄层层层层析析法法纸纸分分配配层层析析法法其他其他分分配配层层析析法法正正相相分分配配层层析析法法反反相相分分配配层层析析法法毛细管电泳毛细管电泳凝胶渗透层析法凝胶渗透层析法离子交换层析法离子交换层析法亲和层析法亲和层析法四、层析技术分类吸附层析法(absorption chromatography)：固定相是固体吸附剂，利用各组份在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。分配层析(partition chromatography)：固定相为液体，利用各组份在两液相中的分配系数不同而分离。离子交换层析(ion exchange chromatography)：是以具有离子交换性能的离子交换剂作固定相，利用他与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。四、层析技术分类凝胶层析（gel chromatography）：固定相为多孔性凝胶，利用各组份的分子大小、形状不同，在凝胶上受阻滞的程度不同而得到分离。亲和层析(affinity chromatography)：利用待分离物质和他的特异性配体间具有特异亲和力从而与其他组份分离，如免疫亲和层析。以上各种层析法常应用于柱层析(column chromatography)中，即将固定相装于柱内，使标本沿一个方向移动而达到分离。离子交换层析原理示意图免疫亲和层析 免疫亲和层析 五、高效液相层析高效液相层析（High performance liquid chromatography，HPLC）在经典液相色谱和气相色谱的基础迅速发展技术由于固相填料颗粒小而均匀，会引起高阻力，采用高压输送流动相，可大大加快分析速度，故又称高压液相色谱高效液相色谱仪一般由高压输液系统、进样分离系统、检测系统、数据系统等组成。高效液相分析仪结构示意图 储液器储液器输液泵输液泵选择装置选择装置层析柱层析柱检测器检测器数据处理系统数据处理系统馏分装置馏分装置五、高效液相层析正相层析法：固定相极性大于流动相极性正相层析由于极性化合物更容易被极性固定相所保留正相层析流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。正相层析法一般可用于分离纯化极性大的分子，如磷脂、甾体化合物、脂溶性维生素、前列腺素等五、高效液相层析反相层析法：流动相极性大于固定相极性反相层析流出顺序极性大的先流出，极性小的后流出，与正相正好相反反相层析用于分离非极性或弱极性化合物，如氨基酸和多肽的分析,蛋白质的分离、碱基、核酸和核酸酶的分析、甾体化合物的分析五、高效液相层析反相层析最为常用，优点：反相层析用流动相的价格比正相层析便宜对操作环境的污染较小非极性固定相表面的作用力弱，故色谱柱达到平衡比较快梯度洗脱的柱子更易于“再生”第21页第21页一、氨基酸测定方法概述 氨基酸检测方法主要有筛查试验和定量试验 纸层析和薄层层析法用于氨基酸分析鉴定 离子交换法常用于氨基酸的分离、定量测定 全自动氨基酸分析仪应用，可对各种体液中 氨基酸进行测定 特异性强灵敏度高的酶法及HPLC第一节 体液氨基酸测定第22页1氨基酸自动分析仪采用离子交换层析方式，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析一一次进样检测2050种氨基酸，不需要更换体系，自动完成仪器基本结构及原理同普通HPLC相似，针对氨基酸分析细节优化，如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及柱温梯度控制等样品用量只需数十至数百微升,在30min左右,即可测出各种氨基酸含量第23页2HPLC法第23页定量分析氨基酸及衍生物的技术定量分析氨基酸及衍生物的技术反相层析技术使微量的氨基酸得到分离和定量反相层析技术使微量的氨基酸得到分离和定量大多数氨基酸无紫外吸收及和荧光发射特征大多数氨基酸无紫外吸收及和荧光发射特征为了提高检测微量氨基酸的灵敏度，在为了提高检测微量氨基酸的灵敏度，在HPLC前先在氨基酸上标前先在氨基酸上标记能产生荧光或紫外有较强吸收的化学物质记能产生荧光或紫外有较强吸收的化学物质HPLC分离后可以直接用荧光检测仪或紫外检测仪分离后可以直接用荧光检测仪或紫外检测仪高灵敏度地检测和定量各种氨基酸高灵敏度地检测和定量各种氨基酸第24页3.纸层析和薄层层析第24页纸层析和薄层层析是分离鉴定微量氨基酸纸层析和薄层层析是分离鉴定微量氨基酸最简易有效的方法最简易有效的方法不需特殊设备和操作简单不需特殊设备和操作简单采集在滤纸上的标本可以邮寄采集在滤纸上的标本可以邮寄纸层析灵敏度低、分辨率差、费时纸层析灵敏度低、分辨率差、费时已经逐渐被速度快、分辨率和灵敏度高的薄层色谱所代替已经逐渐被速度快、分辨率和灵敏度高的薄层色谱所代替这两类层析均为定性检测这两类层析均为定性检测第25页4比色法第25页氨基酸与茚三酮加热产生显色物质的原理设计氨基酸与茚三酮加热产生显色物质的原理设计荧光法检测灵敏度高将其方法代替荧光法检测灵敏度高将其方法代替利用某些氨基酸的特性利用某些氨基酸的特性某些化学物质和特异性的氨基酸起反应可以产生有色某些化学物质和特异性的氨基酸起反应可以产生有色物质等物质等色氨酸和甲醛缩合，并被三氯化铁氧化，生成荧光物色氨酸和甲醛缩合，并被三氯化铁氧化，生成荧光物质去甲哈尔曼质去甲哈尔曼用荧光分光光度法进行检测用荧光分光光度法进行检测第26页5酶法分析第26页某些氨基酸在特定酶的作用下发生分解或合成某些氨基酸在特定酶的作用下发生分解或合成反应，同时伴有反应，同时伴有NAD+与与NADH之间的转化之间的转化,在在340 nm监测吸光度的变化监测吸光度的变化,可测定氨基酸的含量。可测定氨基酸的含量。也可在酶的作用下产生显色物质，测定吸光度也可在酶的作用下产生显色物质，测定吸光度的变化。的变化。第27页第27页 二、离子交换层析法测定氨基酸二、离子交换层析法测定氨基酸离子交换层析用离子交换剂作固定相离子交换层析用离子交换剂作固定相固定相中的基团与流动相中的离子进行可逆的交换固定相中的基团与流动相中的离子进行可逆的交换分离样品混合物，其中带电荷量少，亲和力小的先分离样品混合物，其中带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来被洗脱下来带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸的的的的离离离离子子子子交交交交换换换换分分分分离离离离氨基酸是两性电解质，分子上的净电荷取决于氨基酸的pI和溶液的pH各种氨基酸分子结构不同，在同一pH值时所带正负电荷的性质不同，所带的电荷量也不同与离子交换树脂的亲和力有差异根据从小到大的亲和力顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的目的。二、离子交换层析法测定氨基酸收集不同的组分第32页二、离子交换层析法测定氨基酸二、离子交换层析法测定氨基酸测定洗脱液吸光度即可绘得洗脱曲线测定洗脱液吸光度即可绘得洗脱曲线此计算出该蛋白质中各种氨基酸的含量此计算出该蛋白质中各种氨基酸的含量从洗脱峰的位置来判断属于哪一种氨基酸从洗脱峰的位置来判断属于哪一种氨基酸氨基酸分析仪就是根据这个原理设计制造的自氨基酸分析仪就是根据这个原理设计制造的自动化分析仪动化分析仪氨基酸氨基酸混合样混合样品品阳离子阳离子交换树交换树脂脂 洗脱洗脱 不含有氨基酸部分不含有氨基酸部分控制洗脱液的流量控制洗脱液的流量氨氨基基酸酸浓浓度度 洗脱时间洗脱时间 阳性离子交换树脂分离氨基酸阳性离子交换树脂分离氨基酸第34页第34页三、离子交换层析法性能评价三、离子交换层析法性能评价1.由于离子交换层析法耗时长，分析过程复杂由于离子交换层析法耗时长，分析过程复杂因此在分析生物样品时，快速敏感的反相高效液相色谱法因此在分析生物样品时，快速敏感的反相高效液相色谱法应用较多应用较多很微量的氨基酸样品都可以得到分离和定量很微量的氨基酸样品都可以得到分离和定量2.HPLC虽然此方法由于有较好的可靠性而被广泛使用虽然此方法由于有较好的可靠性而被广泛使用操作过程中样品准备以及层析分离过程复杂操作过程中样品准备以及层析分离过程复杂操作技术要求高，仪器价格昂贵，层析柱寿命短操作技术要求高，仪器价格昂贵，层析柱寿命短有机试剂可造成环境污染，样品测定成本高有机试剂可造成环境污染，样品测定成本高 第35页三、离子交换层析法性能评价三、离子交换层析法性能评价3.如用茚三酮与洗脱液中的氨基酸反应，只能检测到如用茚三酮与洗脱液中的氨基酸反应，只能检测到nmol的水平的水平用荧光试剂（邻苯二醛）用荧光试剂（邻苯二醛）,可检出可检出pmol水平的氨基酸水平的氨基酸缺点是亚氨基酸不发生反应缺点是亚氨基酸不发生反应必须加入某些氧化剂必须加入某些氧化剂(如次氯酸钠如次氯酸钠)后才发生荧光反应后才发生荧光反应荧光的激发波长为荧光的激发波长为340 nm,发射波长为发射波长为455 nm。