适宜技术应对结核感染实用版课件

适宜技术应对结核感染适宜技术应对结核感染1背景背景结核病流行现状结核病流行现状全球有三分之一人口（20亿）亿）感染了结核杆菌我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4背景结核病流行现状全球有三分之一人口（20亿）感染了结核杆背景背景结核病感染、传播、发病过程结核病感染、传播、发病过程潜伏感染染肺病或其他疾病 潜伏感染复发 细菌在人体复制播散Disseminates发作Onset康复Recovery时间表Time诊断Diagnosis治疗Treatment痊愈2个月（months）背景结核病感染、传播、发病过程潜伏感染染肺病或其他疾病背景背景当前结核病的研究当前结核病的研究新型抗结核药物新型抗结核药物(50%)(50%)新型快速诊断技术新型快速诊断技术(40%)(40%)新型结核疫苗新型结核疫苗(10%)(10%)JID 2012:205(Suppl 2),S147.背景当前结核病的研究新型抗结核药物(50%)JID201背景背景结核分枝杆菌基础结核分枝杆菌基础结核分枝杆菌（结核分枝杆菌（M.tuberculosisM.tuberculosis）简称为简称为结核杆菌结核杆菌（tubercle tubercle bacillibacilli）。早在）。早在18821882年，德国细菌年，德国细菌学家学家柯赫柯赫（Robert KochRobert Koch）就已证明）就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。感染最多见。在微生物分类中，结核分枝杆菌属于在微生物分类中，结核分枝杆菌属于放线菌门、放线菌纲、放线菌目、分放线菌门、放线菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属枝杆菌科、分枝杆菌属分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌菌是人类主要的致病菌背景结核分枝杆菌基础结核分枝杆菌（M.tuberculo背景背景结核分枝杆菌基础结核分枝杆菌基础（1 1）结核杆菌可经多途径感染，由呼吸道、消化道和破损皮肤侵入）结核杆菌可经多途径感染，由呼吸道、消化道和破损皮肤侵入机体，最常见为经呼吸道感染引起肺结核。机体，最常见为经呼吸道感染引起肺结核。（2 2）结核杆菌无内毒素和外毒素，也不产生侵袭性酶，其致病性主）结核杆菌无内毒素和外毒素，也不产生侵袭性酶，其致病性主要与其细胞壁内含大量脂质有关。主要包括：要与其细胞壁内含大量脂质有关。主要包括：磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关 分枝菌酸：与抗酸染色性有关分枝菌酸：与抗酸染色性有关 索状因子：可破坏细胞线粒体膜，与慢性肉芽肿形成有关索状因子：可破坏细胞线粒体膜，与慢性肉芽肿形成有关 硫酸脑苷酯：抑制吞噬溶酶体形成，具有抗吞噬作用硫酸脑苷酯：抑制吞噬溶酶体形成，具有抗吞噬作用 蜡质蜡质D D，可刺激机体的迟发型超敏反应。，可刺激机体的迟发型超敏反应。（3 3）结核杆菌主要引起细胞免疫反应，属于传染性免疫）结核杆菌主要引起细胞免疫反应，属于传染性免疫背景结核分枝杆菌基础（1）结核杆菌可经多途径感染，由呼吸道背景背景-结核病患者的发现结核病患者的发现症状：症状：肺结核病可疑症状肺结核病可疑症状者，主要指有咳嗽、者，主要指有咳嗽、咳痰二周以上者咳痰二周以上者,或有咯血症状者或有咯血症状者发现方式：发现方式：因症求诊、转诊和因症求诊、转诊和因症推荐因症推荐 是发现是发现肺结核病人的主要肺结核病人的主要方式方式背景-结核病患者的发现症状：JInfectDis,2011,204:S1120-1129.结果符合的为286例，总符合率为92.一、结核分枝杆菌探针溶解曲线技术生命力旺盛的病原体RNA转录活跃我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/42、对于羁押人员、医务人员、来自结核病高负担国家的移民、无家可归者、以及吸毒人员，可以有条件地开展LTBI系统检测和治疗。有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散原理：将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对TB特异性引物、一对特异性探针，同时结核菌素试验（TST）JID2012:205(Suppl2),S147.磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养肺结核病可疑症状者，主要指有咳嗽、咳痰二周以上者,或有咯血症状者gordonae（戈登）RNA拷贝数DNA拷贝数GeneXpert设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提取、rpoB实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变SIRESusceptibilityoptions:我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4体外r-干扰素释放试验背景背景-结核病患者的诊断结核病患者的诊断肺结核诊断标准：按照新修订的肺结核诊断标准（WS288-2008），肺结核分确诊病例、临床诊断病例和疑似病例。JInfectDis,2011,204:S1120背景背景-结核病实验室的任务结核病实验室的任务Provide Early and Accurate Diagnosis 提供早期精准诊断Initiationofrighttreatmentandinterventionearly制定正确治疗方案并早期干预Monitoringtherapyefficacyinapromptmanner迅速的监测疗效Treatmentanddiagnosiscompanionintuberculosisdrugdevelopment在开发抗结核药物同时发展新的治疗及诊断手段背景-结核病实验室的任务结核病实验室诊断技术简介结核病实验室诊断技术简介1.结核抗体结核抗体2.结核蛋白结核蛋白芯片芯片3.体外体外r-干干扰素试验扰素试验4.结核杆菌结核杆菌分泌抗原分泌抗原1.涂片涂片2.培养培养3.药敏药敏4.菌型鉴定菌型鉴定细菌学细菌学免疫学免疫学分子生物学分子生物学其其 他他1.HPLC2.质谱技术质谱技术3.流式技术流式技术1.实时荧光实时荧光定量定量PCR2.DNA3.RNA4.耐药基因耐药基因突变突变5.菌型鉴定菌型鉴定6.测序测序结核病实验室诊断技术简介1.结核抗体1.涂片细菌学免疫学分子XpertMTB/RIF在MDR或HIV问题不十分严重的地区，可以考虑作为显微镜检查基础之上的后续检测，特别是用于涂阴标本的进一步检测。IncrementalvalueofT-SPOT.1、在HIV感染人群、与肺结核患者密切接触的成人和儿童、开始接受抗肿瘤坏死因子（TNF）治疗的患者、接受透析治疗的患者、准备接受器官或血液移植的患者、以及硅肺患者中开展LTBI系统检测和治疗。RNA远不如DNA稳定，病原体死亡，RNA很快降解Treatmentanddiagnosiscompanionintuberculosisdrugdevelopment结核菌素试验（TST）基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率新型结核疫苗(10%)EpiCenterfor结核病实验室诊断技术简介KangYA,LeeHW,HwangSSetal.我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4其中MDR-TB菌株75例（14.总符合率超过90%。我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4InitiationofrighttreatmentandinterventionearlyTBfordiagnosisofactivepulmonarytuberculosisinchildreninahigh-burdensetting:amultivariableanalysis.PZAKit4-21天CO2O253，总符合率95.ClinTher,2012,34:1041-1048.治疗Treatment结核分枝杆菌形态学检测结核分枝杆菌形态学检测1.1.直接抹片法直接抹片法直接抹片法直接抹片法2.2.离心制片法离心制片法离心制片法离心制片法1.1.抗酸染色抗酸染色抗酸染色抗酸染色2.2.荧光染色荧光染色荧光染色荧光染色1.1.普通显微镜普通显微镜普通显微镜普通显微镜2.2.荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜3.3.自动阅片技术自动阅片技术自动阅片技术自动阅片技术涂片涂片染色染色镜检镜检XpertMTB/RIF在MDR或HIV问题不十分严重的结核杆菌形态学检测结核杆菌形态学检测-离心制片技术离心制片技术直直接接涂涂片片法法离心制片法离心制片法合合 计计阳阳 性性阴阴 性性阳阳性性41410 04141(15.9%)(15.9%)阴阴性性1717199199216216(84.1%)(84.1%)合合计计5858（22.6%22.6%）199199(77.4%)(77.4%)25725720152015年年7 7月至月至20152015年年1111月，对本院月，对本院257257例痰液和纤维支气管镜灌洗液进行例痰液和纤维支气管镜灌洗液进行直接涂片法和离心制片法比对验证试验，结果如下：直接涂片法和离心制片法比对验证试验，结果如下：结论：离心制片法的确能提高结核杆菌涂片检测的阳性率。结论：离心制片法的确能提高结核杆菌涂片检测的阳性率。结核杆菌形态学检测-离心制片技术直离心制片法合计阳性阴结核杆菌形态学检测结核杆菌形态学检测-自动阅片技术自动阅片技术20162016年年2 2月至月至20162016年年3 3月，本院对月，本院对308308例涂片进行人工阅片例涂片进行人工阅片和计算机自动阅片比对试验；结果符合的为和计算机自动阅片比对试验；结果符合的为286286例，总符例，总符合率为合率为92.58%92.58%。结核杆菌形态学检测-自动阅片技术2016年2月至2016年结核病诊断金标准结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养结核分枝杆菌培养分枝杆菌全自动连续检测系统分枝杆菌全自动连续检测系统-BACTEC MGIT 960操作简单操作简单安全可靠安全可靠性能优异性能优异高性能价格比高性能价格比M=MycobacteriumG=GrowthI=IndicatorT=Tube结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养分枝杆菌全自动连续检测系统结核病诊断金标准结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养结核分枝杆菌培养检测对象CO2 O2检测手段颜色 荧光发光元素培养基改良Middle Brook 7H9营养添加剂抑菌剂 灵敏，快速，安全阴性培养阴性培养无荧光或弱荧光无荧光或弱荧光阳性培养阳性培养FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光强荧光传感器传感器肉汤肉汤上部空间上部空间结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养阴性培养无荧光或弱荧光阳性结核病诊断金标准结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养结核分枝杆菌培养简单的工作流程结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养简单的工作流程结核病诊断金标准结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养结核分枝杆菌培养BACTEC MGIT 960 阳性结果判读阳性结果判读1.抗酸染色抗酸染色2.普通培养普通培养血平板血平板3.MPB64抗原检测抗原检测结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养BACTECMGIT9结核病诊断金标准结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养结核分枝杆菌培养BACTEC 9120 只能做血培养？只能做血培养？标本：血液、无菌体液标本：血液、无菌体液我可以的！我可以的！-普通细菌、真菌普通细菌、真菌分枝杆菌分枝杆菌结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养BACTEC9120只结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌体外药敏试验结核杆菌体外结核杆菌体外药敏试验药敏试验MIC测定法测定法固固 体体培养法培养法液体液体仪器法仪器法液体液体微量法微量法结核分枝杆菌体外药敏试验结核杆菌体外MIC固体液体液体结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌体外药敏试验药敏系统采用药敏系统采用NCCLs 推荐的比例法推荐的比例法(MOP)，判断的临界，判断的临界值为值为1%药敏试剂包括药敏试剂包括:SIRE Kit(Streptomycin,Isoniazid,Rifampin and Ethambutol)4-13天天PZA Kit 4-21天天SIRE Susceptibility options:另有单独包装的高浓度药物另有单独包装的高浓度药物S，I，E (在低浓度耐药情况下，可用于高浓在低浓度耐药情况下，可用于高浓度实验度实验)BACTEC MGIT 960 药敏系统药敏系统结核分枝杆菌体外药敏试验药敏系统采用NCCLs推荐的比例法结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌体外药敏试验MGIT PlasticTubesBACTEC 960 SIRE KITMyco/F Lytic25 packBACTEC 960PZA Kit960 directLISBACTEC 960 for G&DManualMGITBACTEC 460TBBACTEC9000MB2003BDisalwaystheLEADER结核分枝杆菌药敏试验的金标准结核分枝杆菌药敏试验的金标准-MGIT960EpiCenter forthe 960结核分枝杆菌体外药敏试验MGITPlasticBACTECUtilityofinterferon-releaseassayresultstomonitoranti-tuberculartreatmentinadultsandchildren.体外r-干扰素释放试验1%(478/508)CO2O2ProvideEarlyandAccurateDiagnosisIGRA诊断LTBI的价值RNA作为临床分子诊断靶标的优点：新型抗结核药物(50%)总符合率超过90%。新型快速诊断技术(40%)另有单独包装的高浓度药物S，I，Egordonae（戈登）药敏系统采用NCCLs推荐的比例法(MOP)，判断的临界值为1%结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养实际上，世界卫生组织专家组基于现有的证据明确指出，在中低收入国家不能以IGAR代替常规的微生物诊断方法用于肺结核和肺外结核的诊断3。体外r-干扰素释放试验原理：将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对TB特异性引物、一对特异性探针，同时TB-RNA阳性例数其中MDR-TB菌株75例（14.全球有三分之一人口（20亿）感染了结核杆菌Treatmentanddiagnosiscompanionintuberculosisdrugdevelopment磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌体外药敏试验 Drug free Isoniazid Ethambutol Inoculum media 0.2 mcg/ml 2.0 mcg/ml 10-3 +3 10-5 26 9 0%resistant 34.6 0.1Interpretation Resistant SusceptibleUtilityofinterferon-releas结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌体外药敏试验1234 挑取菌落挑取菌落磨菌、稀释磨菌、稀释接种菌液接种菌液孵育孵育7-107-10天天显色，显色，读取结果读取结果结核分枝杆菌液体微量药敏结核分枝杆菌液体微量药敏结核分枝杆菌体外药敏试验1234挑取菌落孵育7-10天显色结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验 收集我院收集我院2015年年8月至月至11月的临床分离菌株月的临床分离菌株511例，例，使用液体微量显色法进行了使用液体微量显色法进行了利福平、异烟肼、链霉素、利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺对氨基水乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等卡那霉素、氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的体外药敏试十四种抗结核药物的体外药敏试验验。其中。其中MDR-TBMDR-TB菌株菌株7575例（例（14.7%14.7%）。）。药物药物RFPRFPINHINHSMSMEMBEMBCPMCPMOFXOFXETHETHPASPASLVFLVFMOFMOFRFBRFBAMIAMIKANKANCLOCLO耐药耐药例数例数8080146146949458585050616141414949535362626060111113138787耐药率耐药率%15.715.728.628.618.418.411.411.49.89.811.911.98.08.09.69.610.410.412.112.111.711.72.22.22.52.517.017.0结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验药结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验比对实验结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验比对实验 收集临床分离菌株和国家参比室的质控菌株收集临床分离菌株和国家参比室的质控菌株117117例，使例，使用液体微量显色法和罗氏比例法进行了利福平、异烟肼、链用液体微量显色法和罗氏比例法进行了利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺、对氨霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的比对实验。氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的比对实验。总符合率超过总符合率超过90%90%。结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验比结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断一、结核分枝杆菌探针溶解曲线技术一、结核分枝杆菌探针溶解曲线技术结核病分子生物学诊断一、结核分枝杆菌探针溶解曲线技术结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断结结 果果 判判 断断结核病分子生物学诊断结果判断结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断溶解曲线法溶解曲线法比例法药敏比例法药敏敏感度敏感度特异度特异度阳阳 性性预测值预测值%阴阴 性性预测值预测值%总符总符合率合率%敏敏 感感耐耐 药药%INHINH敏敏 感感1101104 490.590.598.298.295.595.596.696.696.196.1耐耐 药药2 23838RFPRFP敏敏 感感1031032 295.895.897.297.294.194.198.198.196.896.8耐耐 药药3 34646收集我院样本库的临床分离菌株收集我院样本库的临床分离菌株154154例，进行了溶解曲线法例，进行了溶解曲线法耐药基因突变分析以及罗氏比例法药敏试验，总符合率在耐药基因突变分析以及罗氏比例法药敏试验，总符合率在96%96%以上。并对耐药结果不相符的以上。并对耐药结果不相符的1111株菌进行了基因测序分株菌进行了基因测序分析，均证实有耐药基因突变。析，均证实有耐药基因突变。结核病分子生物学诊断溶解曲线法比例法药敏敏感度特异度阳性阴结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断二、结核分枝杆菌二、结核分枝杆菌R RNANA检测检测(TB-RNA)(TB-RNA)RNARNA作为临床分子诊断靶标的优点：作为临床分子诊断靶标的优点：RNA RNA 拷贝数拷贝数 DNA DNA拷贝数拷贝数更具临床意义更具临床意义:生命力旺盛的病原体生命力旺盛的病原体RNARNA转录活跃转录活跃RNARNA远不如远不如DNADNA稳定，病原体死亡，稳定，病原体死亡，RNARNA很快降解很快降解 1.1.交叉污染少交叉污染少 2.2.较好的愈后指标较好的愈后指标结核病分子生物学诊断二、结核分枝杆菌RNA检测(TB-RNA结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断 统计今年我院住院患者统计今年我院住院患者179179例，分析涂片、例，分析涂片、培养和培养和TB-RNATB-RNA检测报告，结果如下：检测报告，结果如下：患者类型患者类型例数例数TB-RNA TB-RNA 阳性例数阳性例数阳性率阳性率涂片阳性涂片阳性2727232385.2%85.2%涂片阴性涂片阴性142142414128.9%28.9%培养阳性培养阳性6868626291.1%91.1%培养阴性培养阴性1111112 21.8%1.8%我院涂片、培养阳性率分别为：我院涂片、培养阳性率分别为：15.1%15.1%和和37.9%37.9%；TB-RNATB-RNA的总阳性率为的总阳性率为35.8%35.8%。结核病分子生物学诊断统计今年我院住院患者179例结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断三、三、EasyNAT TB-DNAEasyNAT TB-DNA检测（恒温扩增法）检测（恒温扩增法）原理：将病原体原理：将病原体DNADNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对TBTB特异特异性引物、一对特异性探针，同时性引物、一对特异性探针，同时 一次性完成一次性完成TB DNATB DNA的扩增及杂交的扩增及杂交 过程，然后用一次性核酸检测装过程，然后用一次性核酸检测装 置进行定性诊断。置进行定性诊断。检测目标片段检测目标片段:目标为结核分枝杆菌目标为结核分枝杆菌 特异性特异性IS6110IS6110片段。片段。结核病分子生物学诊断三、EasyNATTB-DNA检测（恒结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断操作步骤操作步骤结核病分子生物学诊断操作步骤结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断 20152015年年6 6月，我科参加月，我科参加CTCTCCTCTC“EasyNATEasyNAT结核分枝杆菌核酸结核分枝杆菌核酸检测试剂盒现场应用评估检测试剂盒现场应用评估”项目项目,结果如下结果如下：患者类型患者类型例数例数EasyNAT TB-DNAEasyNAT TB-DNA检测检测阳性率阳性率%阳性阳性阴性阴性涂片阳性涂片阳性7 77 70 0100.0100.0涂片阴性涂片阴性43432 241414.74.7培养阳性培养阳性10109 91 1*90.090.0培养阴性培养阴性40400 040400.00.0注注*：1 1例培养阳性最终鉴定为非结核分枝杆菌例培养阳性最终鉴定为非结核分枝杆菌结核病分子生物学诊断2015年6月，我科参加CTCTC过程，然后用一次性核酸检测装结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验比对实验2003BDisalwaystheLEADER播散DisseminatesPZAKit4-21天体外r-干扰素释放试验2015年7月至2015年11月，对本院257例痰液和纤维支气管镜灌洗液进行直接涂片法和离心制片法比对验证试验，结果如下：53，总符合率95.JInfectDis,2011,204:S1120-1129.93%，QFT-GIT（7项研究）在结核病患者抗结核治疗后转阴率为14.收集我院样本库的临床分离菌株154例，进行了溶解曲线法耐药基因突变分析以及罗氏比例法药敏试验，总符合率在96%以上。marinum（海）、M.2003BDisalwaystheLEADERInitiationofrighttreatmentandinterventionearly总符合率超过90%。JID2012:205(Suppl2),S147.我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4WHO推荐TB实验室诊断路径结核分枝杆菌形态学检测其中MDR-TB菌株75例（14.结核分枝杆菌液体微量药敏RNA拷贝数DNA拷贝数结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断四、四、Gen-Xpert MTB/RIFGen-Xpert MTB/RIF进行标本处理、实时进行标本处理、实时PCRPCR和利福平耐药性检测的完整平台和利福平耐药性检测的完整平台痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理处理GeneXpert GeneXpert 设备可进行标本液化、去污染、富集、设备可进行标本液化、去污染、富集、DNADNA提提取、取、rpoB rpoB实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变容易使用，不需要进行分子生物学培训容易使用，不需要进行分子生物学培训操作完全自动化，操作完全自动化，使用起来既容易又安全使用起来既容易又安全。过程，然后用一次性核酸检测装结核病分子生物学诊断四、Gen-结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断Xpert MTB/RIFXpert MTB/RIF与与PCR TB-DNAPCR TB-DNA检测的比较：检测的比较：阳性符合率阳性符合率99.0399.03，阴性符合率，阴性符合率92.6192.61，总符合率，总符合率95.3195.31Gen-XpertPCR TB-DNAPCR TB-DNA合计合计阳性阳性阴性阴性阳阳 性性2042042121225225阴阴 性性2 2263263265265合合 计计206206284284490490结核病分子生物学诊断XpertMTB/RIF与PCRTB结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断涂片阳性肺结核涂片阳性肺结核:Xpert:Xpert 检出率检出率=99.35=99.35涂片阴性肺结核涂片阴性肺结核:Xpert:Xpert 检出率检出率=35.32=35.32Gen-Xpert涂片结果涂片结果合计合计阳性阳性阴性阴性阳阳 性性1521527171223223阴阴 性性1 1130130131131合合 计计153153201201354354结核病分子生物学诊断涂片阳性肺结核:Xpert检出率=9结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断Xpert MTB/RIFXpert MTB/RIF与与BD960BD960液体培养比较实验：液体培养比较实验：阳性符合率阳性符合率95.5295.52，阴性符合率，阴性符合率95.5195.51，总符合率，总符合率=95.5195.51Gen-Xpert培养培养+鉴定结果鉴定结果合计合计阳性阳性阴性阴性阳性阳性2132131212225225阴性阴性1010255255265265合计合计223223267267490490结核病分子生物学诊断XpertMTB/RIF与BD960液结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断Xpert MTB/RIFXpert MTB/RIF与比例法药敏比较实验：与比例法药敏比较实验：阳性符合率阳性符合率 96.8896.88，阴性符合率，阴性符合率 95.5395.53，总符合，总符合率率 95.7395.73，Gen-Xpert利福平药敏试验利福平药敏试验合计合计耐药（阳性）耐药（阳性）敏感（阴性）敏感（阴性）耐药（阳性）耐药（阳性）31318 83939不确定不确定0 02 22 2敏感（阴性）敏感（阴性）1 1171171172172合计合计3232179179211211结核病分子生物学诊断XpertMTB/RIF与比例法药敏比结核病分子生物学诊断结核病分子生物学诊断WHOWHO关于关于Xpert MTB/RIFXpert MTB/RIF的的建议建议Xpert MTB/RIF Xpert MTB/RIF 应该用于应该用于MDR-TBMDR-TB的高危人群、的高危人群、以便尽早发现以便尽早发现MDR-TBMDR-TB患者，有效控制疫情。患者，有效控制疫情。Xpert MTB/RIF Xpert MTB/RIF 在在MDRMDR或或HIVHIV问题不十分严重问题不十分严重的地区，可以考虑作为显微镜检查基础之上的地区，可以考虑作为显微镜检查基础之上的后续检测，特别是用于涂阴的后续检测，特别是用于涂阴标本标本的进一步的进一步检测。检测。结核病分子生物学诊断WHO关于XpertMTB/RIF的建体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验蛋白质水平结核菌素核菌素试验（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TB Gold in-tube(QFT-GI)体外r-干扰素释放试验蛋白质水平结核菌CO2O2这些资料清楚地表明，在中低收入国家，IGRA和TST一样对于诊断成人活动性结核病没有任何价值1。二、结核分枝杆菌RNA检测(TB-RNA)无论是HIV感染者还是非HIV感染者，IGRA的诊断效率与TST相比较均无优势。AnnInternMed,2007,146:340-354.gordonae（戈登）我院涂片、培养阳性率分别为：15.播散DisseminatesChiappini等在2012年发表的一篇meta分析中指出，T-SPOT.颜色荧光53，总符合率95.体外r-干扰素释放试验Treatmentanddiagnosiscompanionintuberculosisdrugdevelopment我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散其中MDR-TB菌株75例（14.新型抗结核药物(50%)JInfectDis,2011,204:S1120-1129.另有单独包装的高浓度药物S，I，ETB-RNA阳性例数LingDI,NicolMP,PaiM,etal.体外r-干扰素释放试验体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验干扰素干扰素检测阴性检测阴性干扰素干扰素检测阳性检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞 干扰素CO2O2体外r-体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验特异性特异性 只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（菌和卡介苗（BCGBCG）无交叉反应）无交叉反应 美国美国FDAFDA数据：特异性数据：特异性97.1%(297/306)97.1%(297/306)国内临床数据：特异性国内临床数据：特异性94.1%(478/508)94.1%(478/508)灵敏度灵敏度 基本不受免疫力低下基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率很高的检出率 美国美国FDAFDA数据：灵敏度数据：灵敏度95.6%(175/183)95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)95.3%(624/655)体外r-干扰素释放试验特异性体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验阴性阴性结果果阳性阳性结果果空白空白对照照抗原抗原AESAT-6抗原抗原BCFP10阳性阳性对照照（PHA）实验效果图实验效果图体外r-干扰素释放试验阴性结果阳性结果空白对照实验效果图体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验检测特异性的提高检测特异性的提高帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的引起的“假阳性假阳性”，避免了临床的无效用药，避免了临床的无效用药检测灵敏度的提高检测灵敏度的提高有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散了疾病的传播与扩散快速快速48小时出结果小时出结果体外r-干扰素释放试验检测特异性的提高体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验阴性结果阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性细胞。假阴性结果：结果：感染阶段不同；感染阶段不同；少数免疫系统功能不全少数免疫系统功能不全/疾病；疾病；实验非正实验非正常操作。常操作。阳性结果阳性结果提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：测指标综合判断。假阳性结果：4种环境分枝杆菌感染时：种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、（苏氏）、M.marinum（海）、（海）、M.gordonae（戈登）（戈登）体外r-干扰素释放试验阴性结果体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验WHO 2014 WHO 2014 潜伏结核感染管理指南潜伏结核感染管理指南建议：建议：1、在HIV感染人群、与肺结核患者密切接触的成人和儿童、开始接受抗肿瘤坏死因子（TNF）治疗的患者、接受透析治疗的患者、准备接受器官或血液移植的患者、以及硅肺患者中开展LTBI系统检测和治疗。检测LTBI建议使用-干扰素释放试验（IGRA）或结核菌素皮试（TST）。2、对于羁押人员、医务人员、来自结核病高负担国家的移民、无家可归者、以及吸毒人员，可以有条件地开展LTBI系统检测和治疗。3、对于糖尿病人、酒精依赖者、吸烟成瘾者、低体重者，如果他们不属于以上1和2的情况，并不建议常规开展LTBI的系统检测。体外r-干扰素释放试验WHO2014潜伏结核感染管理指体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验LTBILTBI筛查和诊断的建议流程筛查和诊断的建议流程体外r-干扰素释放试验LTBI筛查和诊断的建议流程体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验Menzies等在2007年发表的一篇纳入8项研究的meta分析论文中指出，IGRA对于普通人群，尤其是曾经接种过卡介苗的人群诊断LTBI具有较高的特异度；但和TST一样，IGRA的敏感度差强人意，两者均不能区别LTBI和活动性结核病-MenziesD,PaiM,ComstockG.Meta-analysis:newtestsforthediagnosisoflatenttuberculosisinfection:areasofuncertaintyandrecommendationsforresearch.AnnInternMed,2007,146:340-354.IGRA诊断诊断LTBI的价值的价值体外r-干扰素释放试验Menzies等在2007年发表的一篇体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验IGRAIGRA诊断活动性结核病的价值诊断活动性结核病的价值 在南非进行的1项募集到491例痰涂阴疑为肺结核患儿的研究中，结合临床资料、胸片以及TST结果诊断肺结核的曲线下面积为85%（95%CI 80%90%）。该研究最重要的价值在于发现，T-SPOT.TB相对于临床资料、胸片以及TST的综合判断价值而言，并没有增加额外的诊断价值。LingDI,NicolMP,PaiM,etal.IncrementalvalueofT-SPOT.TBfordiagnosisofactivepulmonarytuberculosisinchildreninahigh-burdensetting:amultivariableanalysis.Thorax,2013,68:860-866.体外r-干扰素释放试验IGRA诊断活动性结核病的价值体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验无论是HIV感染者还是非HIV感染者，IGRA的诊断效率与TST相比较均无优势。这些资料清楚地表明，在中低收入国家，IGRA和TST一样对于诊断成人活动性结核病没有任何价值1。另有研究指出，IGRA较低的阳性预测值限制其在中低收入国家成为临床常规检测活动性结核的手段2。实际上，世界卫生组织专家组基于现有的证据明确指出，在中低收入国家不能以IGAR代替常规的微生物诊断方法用于肺结核和肺外结核的诊断3。1.MetcalfeJZ,EverettCK,SteingartKR,etal.Interferon-gammareleaseassaysforactivepulmonarytuberculosisdiagnosisinadultsinlow-andmiddle-incomecountries:systematicreviewandmeta-analysis.JInfectDis,2011,204:S1120-1129.2.KangYA,LeeHW,HwangSSetal.Usefulnessofwhole-bloodinterferon-gammaassayandinterferon-gammaenzyme-linkedimmunospotassayinthediagnosisofactivepulmonarytuberculosis.Chest,2007,132:959-965.3.WHO.StrategicandTechnicalAdvisoryGroupforTuberculosis(STAG-TB):reportofthetenthmeeting.Geneva:WorldHealthOrganization,2010.http:/www.who.int/tb/advisory_bodies/stag_tb_report_2010.pdf.Accessed1December2013.体外r-干扰素释放试验无论是HIV感染者还是非HIV感染者，体外体外r-r-干扰素释放试验干扰素释放试验活动性结核病通过有效的抗结核治疗后，结核杆菌载量下降，效应T细胞数量会随之减少，所以理论上IGRA结果应从阳性转变为阴性，但临床实践中发现IGRA结果转阴率非常低。Chiappini等在2012年发表的一篇meta分析中指出，T-SPOT.TB（3项研究）在结核病患者抗结核治疗后转阴率为5.71%-13.93%，QFT-GIT（7项研究）在结核病患者抗结核治疗后转阴率为14.28%-41.89%，说明IGRA在评价抗结核治疗方面作用是有限的。ChiappiniE,FossiF,BonsignoriF,etal.Utilityofinterferon-releaseassayresultstomonitoranti-tuberculartreatmentinadultsandchildren.ClinTher,2012,34:1041-1048.IGRA在评价抗结核治疗中的效用在评价抗结核治疗中的效用体外r-干扰素释放试验活动性结核病通过有效WHOWHO推荐推荐TBTB实验室诊断路径实验室诊断路径WHO推荐TB实验室诊断路径我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4szulgai（苏氏）、M.结核菌素试验（TST）新型抗结核药物(50%)%resistant34.一次性完成TBDNA的扩增及杂交WHO2014潜伏结核感染管理指南建议：播散Disseminatesgordonae（戈登）EpiCenterforLTBI筛查和诊断的建议流程Inoculummedia0.体外r-干扰素释放试验颜色荧光93%，QFT-GIT（7项研究）在结核病患者抗结核治疗后转阴率为14.TB相对于临床资料、胸片以及TST的综合判断价值而言，并没有增加额外的诊断价值。改良MiddleBrook7H9CO2O2TB-RNA阳性例数背景结核病感染、传播、发病过程Treatmentanddiagnosiscompanionintuberculosisdrugdevelopment结果符合的为286例，总符合率为92.有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散美国FDA数据：灵敏度95.特异性IS6110片段。收集我院样本库的临床分离菌株154例，进行了溶解曲线法耐药基因突变分析以及罗氏比例法药敏试验，总符合率在96%以上。Initiationofrighttreatmentandinterventionearly只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应体外r-干扰素释放试验少数免疫系统功能不全/疾病；ClinTher,2012,34:1041-1048.体外r-干扰素释放试验收集临床分离菌株和国家参比室的质控菌株117例，使用液体微量显色法和罗氏比例法进行了利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、活动性结核病通过有效的抗结核治疗后，结核杆菌载量下降，效应T细胞数量会随之减少，所以理论上IGRA结果应从阳性转变为阴性，但临床实践中发现IGRA结果转阴率非常低。IGRA诊断LTBI的价值磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关该研究最重要的价值在于发现，T-SPOT.WHO2014潜伏结核感染管理指南建议：TB-RNA阳性例数肺结核病可疑症状者，主要指有咳嗽、咳痰二周以上者,或有咯血症状者我院涂片、培养阳性率分别为：15.RNA远不如DNA稳定，病原体死亡，RNA很快降解基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率52，阴性符合率95.60.进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台60.涂片阴性肺结核:Xpert检出率=35.10-3+3提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散IGRA诊断LTBI的价值6%(175/183)marinum（海）、M.结核分枝杆菌形态学检测Geneva:WorldHealthOrganization,2010.Meta-analysis:newtestsforthediagnosisoflatenttuberculosisinfection:areasofuncertaintyandrecommendationsforresearch.Treatmentanddiagnosiscompanionintuberculosisdrugdevelopment53，总符合率95.我院涂片、培养阳性率分别为：15.因症求诊、转诊和因症推荐是发现肺结核病人的主要方式一次性完成TBDNA的扩增及杂交收集我院样本库的临床分离菌株154例，进行了溶解曲线法耐药基因突变分析以及罗氏比例法药敏试验，总符合率在96%以上。少数免疫系统功能不全/疾病；背景结核分枝杆菌基础结核分枝杆菌体外药敏试验有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散4种环境分枝杆菌感染时：M.结论：离心制片法的确能提高结核杆菌涂片检测的阳性率。四、Gen-XpertMTB/RIF一、结核分枝杆菌探针溶解曲线技术硫酸脑苷酯：抑制吞噬溶酶体形成，具有抗吞噬作用全球有三分之一人口（20亿）感染了结核杆菌53，总符合率95.InitiationofrighttreatmentandinterventionearlyCO2O2蛋白质水平AnnInternMed,2007,146:340-354.kansasii（堪萨斯）、M.MetcalfeJZ,EverettCK,SteingartKR,etal.IGRA诊断LTBI的价值PZAKit4-21天gordonae（戈登）BACTECMGIT960阳性结果判读无论是HIV感染者还是非HIV感染者，IGRA的诊断效率与TST相比较均无优势。一次性完成TBDNA的扩增及杂交药敏系统采用NCCLs推荐的比例法(MOP)，判断的临界值为1%10-52690谢谢观看！我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4有利于临