罗氏诊断二代测序技术在HBV耐药检测中应用课件

罗氏氏诊断二代断二代测序技序技术在耐在耐药检测中的中的应用用 罗氏诊断罗氏诊断 应用科学应用科学市场部市场部 刘璐璐刘璐璐罗氏诊断二代测序技术在耐药检测中的应用 罗氏诊断 应用科学 耐药性产生耐药性产生病毒每天高速复制，并在复制时发生错误，这些自发突变导致突变株出现。突变株增殖能力通常低于野生型，因而在未用药的群体中占少数。但在病毒药物作用下，药物对于耐药性的突变有选择作用，导致了耐药菌株成为优势株，导致药物治疗的失败。耐药性产生病毒每天高速复制，并在复制时发生错误，这些自发突2耐药是核苷酸类药物的共性耐药是核苷酸类药物的共性耐药检测的意义耐药检测的意义治疗前检测，有助于临床判断用药治疗前检测，有助于临床判断用药是否有效；是否有效；治疗中每治疗中每 个月检测，有助于观察疗个月检测，有助于观察疗效，及时调整用药效，及时调整用药 ：.,:.用药后出现耐药用药后出现耐药拉米夫定拉米夫定 阿德福韦酯阿德福韦酯 恩替卡韦恩替卡韦 替比夫定替比夫定 替诺福韦替诺福韦耐药是核苷酸类药物的共性 ：.3测序用于病毒耐序用于病毒耐药检测深度深度测序可序可检出低出低频准种准种超深焦磷酸测序可检测低于的准种普通焦磷酸测序仅限及以上的准种毛细管电泳测序仅限及以上的准种提早判断准种组成，在劣势菌种未发展成为优势菌种之前，即调整用药策略；降低治疗失败可能性，减少对身体伤害。测序用于病毒耐药检测深度测序可检出低频准种超深焦磷酸测序普4高深度测序优势高深度测序优势已经成功实现对于基因区段突变位点的发现，比目前常用的一代测序及线性探针反向杂交法更加灵敏进行相对定量，对于病毒群体中突变数量改变进行跟踪深度测序的运用将较传统方法提前个月检测出突变，因此能够更好的抓住治疗的时机并给出治疗的方案高深度测序优势5测序系统发展测序系统发展测序通量及读长不断增加，大小测序平台齐备测序通量及读长不断增加，大小测序平台齐备 20 Mb100 Mb 500 Mb 测序系统发展测序通量及读长不断增加，大小测序平台齐备6独立实验室适用型独立实验室适用型精巧型精巧型 二代测序平台二代测序平台 独立实验室适用型精巧型 二代测序平台 7 测序步骤概览测序步骤概览 测序步骤概览 8 测测序流程序流程 文文库库构建构建.文库构建：文库构建：,*产物可直接测序产物可直接测序传统文文库构建：构建：克隆克隆一个片段一个片段一个反应珠一个反应珠 测序流程 文库构建.文库构建：传统文库构建：一个片段 9 测测序流程序流程.每个分子独立每个分子独立进进行反行反应应后独立后独立测测序序扩扩增效果好，适增效果好，适应应高含量片段、甚至高含量片段、甚至样样本本一个反应珠一个反应珠 一个读长一个读长 测序流程.一个反应珠 一个读长 10单克隆测序的价值单克隆测序的价值通过通过 实现单克隆实现单克隆直接阅读每一种分子结果直接阅读每一种分子结果突变比例的计算（低频）基于实际的序列信息突变比例的计算（低频）基于实际的序列信息每个分子独立进行反应后独立测序每个分子独立进行反应后独立测序扩增效果好，适应高扩增效果好，适应高 含量片段、甚至样本含量片段、甚至样本 流程混合测序 流程单克隆测序单克隆测序的价值通过 实现单克隆直接阅读每一种分子结果 流11测序流程测序流程 测序测序1.特异的测序引物和单链模板结合,加入一种2.聚合酶的作用下，单个 与模板的下一个碱基配对，同时释放出一个分子的焦磷酸()3.在硫酸化酶的作用下，和结合形成4.在荧光素酶的催化下，生成的又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，被捕捉5.降解剩余的和残留的少量6.加入另一种重复步骤7.在每一个测序循环里，碱基以同样的次序()流过板8.当模板链的互补核苷酸加入延伸链时，会产生了荧光信号9.荧光信号强度与所加入的核苷酸数目成比例10.荧光信号被照相机记录荧光素酶荧光素酶 硫酸化酶硫酸化酶氧化荧光素氧化荧光素可见光可见光.基于焦磷酸反基于焦磷酸反应应的的边边合成合成边测边测序序测序流程 测序 特异的测序引物和单链模板结合,加入一种1213 :.边合成合成边测序序 实验体系的不断优化使得当前可获得实验体系的不断优化使得当前可获得 平均为的读长平均为的读长并将继续以提升读长为技术的发展方向之一并将继续以提升读长为技术的发展方向之一13 13测序流程测序流程 数据获取数据获取图像像处理理信号信号处理理测序流程 数据获取图像处理信号处理14测序流程测序流程数据分析数据分析测序与分析同时进行，小时完成小时产出 万条以上的序列自带套软件，满足多数应用需求软件自动过滤，高质量序列比例高 的位置仍可保持的准确性 在德国大肠杆菌事件中在德国大肠杆菌事件中 .,:拥有最长的读长，平均读长在个碱基，的序列可以用于基因组拥有最长的读长，平均读长在个碱基，的序列可以用于基因组拼接拼接月日收到样本，月日完成全部测序与机制确认工作月日收到样本，月日完成全部测序与机制确认工作数据分析仅由的非专业生信团队，不到半天时间即得到结果数据分析仅由的非专业生信团队，不到半天时间即得到结果测序流程数据分析测序与分析同时进行，小时完成 在德15序列读长分布图序列读长分布图 测序系统运行产生的读长范围为，甚至更长 实验将利用几乎全部数据平均读长为典型读长在 范围 实验将主要根据典型读长进行引物设计Number of readsReadlength(bases)序列读长分布图 测序系统运行产生的读长范围为，甚至更长 N16Simple simple 454 long reads?长测序能够带来什么长测序能够带来什么 保证样本的获得，长焦磷酸确保阅读保证样本的获得，长焦磷酸确保阅读Simple simple 454 long reads 17长读长的价值长读长的价值一条通读一个目标序列，无需拼接，避免错误产生与时间消耗通过一条判断突变的连锁关系更少引物获得更多目标引物设计的区间更灵活条既可通读耐药相关基因的产物耐耐药药基因基因()检测检测有的个片段有的个片段()()()(),;():.长读长的价值一条通读一个目标序列，无需拼接，避免错误产生与18扩增子文库的设计扩增子文库的设计长读长给予更多引物设计空间，条通读热点突变区域长读长给予更多引物设计空间，条通读热点突变区域 ()双向测序 (.)()AB 通过序列，可以混合多个样本测序同时测序 基因可设计个产物片段基因可设计个产物片段基因可设计个产物片段基因可设计个产物片段基因可设计个产物片段扩增子文库的设计长读长给予更多引物设计空间，条通读热点突变19测测序在序在 耐耐药药基因基因测测序的序的应应用方案用方案DNA 提取PCR产物的获取PCR产物纯化PCR产物样品定量(Agilent2100,qPCR仪)PCR产物样品均一化PCR产物混样 454测序建库加接头(10min)emPCR扩增(2h手工操作+6h机器运行)454 Junior测序(10h)数据分析测序在 耐药基因测序的应用方案DNA 提取PCR产物的获取P20 测测序步序步骤骤耐耐药检测应药检测应用用(乳滴)扩增每一带有与测序引物的耐药突变高发片段在其各自的微乳滴中进行独立扩增，排除了其它竞争性或污染性序列对 反应的影响。焦磷酸测序将所有结合有片段的磁珠置于(板)中进行测序。板的孔径恰好仅能容纳一颗磁珠。将板置于测序仪中，单个核苷酸依次流经孔洞和捕获磁珠间。当所加入的核苷酸与模板互补时，便产生化学发光信号，进而被系统的相机记录。测序步骤耐药检测应用21的分析的分析结结果呈果呈现现可可检测单检测单点突点突变变的分析结果呈现可检测单点突变22的分析的分析结结果呈果呈现现可关注已知突可关注已知突变变的分析结果呈现可关注已知突变23 24 ,25的分析的分析结结果呈果呈现现可可检测检测有意有意义义的的连锁连锁突突变变位点位点的分析结果呈现可检测有意义的连锁突变位点26已有基因突变数据库已有基因突变数据库 已有基因突变数据库 27 结果展示结果展示 结果展示28近两年使用近两年使用 发表耐表耐药检测文献文献 .,.():.,.()().().,.():.,.():近两年使用 发表耐药检测文献 .,29 测序系统测序系统您身边的二代测序平台您身边的二代测序平台经典可靠：运用测序技术，与经典可靠：运用测序技术，与 测序系统测序系统相同的化学原理，平均读长达相同的化学原理，平均读长达（已发文（已发文献超过篇）献超过篇）经济实用：仪器，计算机及实验配套设经济实用：仪器，计算机及实验配套设备起步成本低备起步成本低简单易用：包括完备的生物信息学分析简单易用：包括完备的生物信息学分析软件，在普通计算机系统即可进行分析软件，在普通计算机系统即可进行分析 !测序系统您身边的二代测序平台经典可靠：运用测序技术，与30We Innovate HealthcareWe Innovate Healthcare31