第三章-免疫分析法(讲课适用)课件

生物药物分析生物药物分析第三章第三章 免疫分析法免疫分析法生物药物分析一、一、概述概述二、二、抗原抗原三、三、抗体与免疫反应抗体与免疫反应四、四、免疫分析方法及应用免疫分析方法及应用主要内容主要内容一、概述主要内容一、一、概述概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用主要内容主要内容一、概述主要内容 免疫学是研究免疫系统的结构与功能免疫系统的结构与功能，了解其在免疫应答反应中对机体有益的防卫功能和有害的病理损伤的机制，研究有效的免疫措施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学学科。一、概述一、概述免疫学是研究免疫系统的结构与功能，了解其在免疫应答反 什么叫免疫分析？什么叫免疫分析？基于抗原和抗体的特异性反应基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原或抗体的检测，用于免疫学诊断。什么叫免疫分析？(1)在实验药物动力学和临床药物学中在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；(2)在药物的临床检测中在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有交叉的药物血液浓度进行监测；(3)在药物生产中在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测；(4)对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。在药物分析中，免疫分析法的在药物分析中，免疫分析法的应用主要集中在以下几方面：应用主要集中在以下几方面：(1)在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度和药物免疫分析免疫分析：利用抗原与抗体的特异性结合作用，来选择性识别和测定，可以作为抗体或抗原的待测物.免疫分析方法免疫分析方法非标记免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生变化非标记免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生变化）标记免疫分析标记免疫分析标记物标记物有无有无非放射免疫分析非放射免疫分析放射免疫分析（放射污染）放射免疫分析（放射污染）酶联免疫分析酶联免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析电化学免疫分析电化学免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析免疫分析免疫分析7优选课堂免疫分析：非标记免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生变化）标记免疫分析免疫分析检测的的发展展放射免疫放射免疫检测（兴起于起于20世世纪70年代年代)酶联免疫免疫检测（兴起于起于20世世纪80年代，年代，各各临床机构普遍使用）；床机构普遍使用）；以化学发光为代表的光生物学标记及免以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术疫检测技术（2020世纪世纪9090年代开始推广使年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。用，产品步入成长期）三个阶段。8优选课堂免疫分析检测的发展放射免疫检测（兴起于20世纪70年代)酶联 特点特点可逆性可逆性比例性比例性反应阶段性反应阶段性特异性特异性免疫分析法的特点免疫分析法的特点特点可逆性比例性特异性免疫分析法的特点特异性特异性特异性特异性：抗原与抗体结合反应的专一性：抗原与抗体结合反应的专一性分子基础分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性空间构型的互补性特异性特异性：抗原与抗体结合反应的专一性可逆性可逆性可逆性：可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体，件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。体均能保持原有的结构和活性。影响因素：影响因素：抗体抗体对相相应抗原的抗原的亲合力合力亲合力越高，合力越高，结合越合越牢固，越不易解离牢固，越不易解离 环境因素境因素对复合物的影响复合物的影响pH、离子、离子强强度度 可逆性可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可比例性和比例性和反应阶段性反应阶段性比例性：比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系量比关系前带前带(prezone)：抗体过量：抗体过量后带后带(postzone)：抗原过量：抗原过量等价带等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例合适：抗原抗体比例合适 比例性和比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系一、概述一、概述二、二、抗原抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用主要内容主要内容一、概述主要内容2.1 定定义抗原（抗原（antigen）：）：指在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。免疫原性（immunogenicity）：被注射入动物体内后，使其产生循生循环抗体或改抗体或改变免疫免疫细胞胞的反应性抗原特异性（antigenic specificity）：具有能与特异与特异抗体作用抗体作用的性质全抗原（complete antigen）半抗原（hapten）：只能与特异抗体作用，但不引起机体免疫应答的分子14优选课堂2.1定义抗原（antigen）：指在机体中引起特异性免疫2.2 药物分子的抗原性物分子的抗原性1、药物分子的免疫原性物分子的免疫原性 大多数的药物分子通常都是半抗原；一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物也是完全抗原。2、药物分子的抗原特异性物分子的抗原特异性 药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性可能会发生改变。15优选课堂2.2药物分子的抗原性1、药物分子的免疫原性15优选课堂3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清，通常会与蛋白与蛋白质载体合成人工抗原体合成人工抗原进行试验。常用载体：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破伤风类毒素（TT）、钥孔蛋白（KLH）等。16优选课堂3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清，通常会与蛋白质载体合（1）半抗原和）半抗原和载体体结合的化学反合的化学反应多多肽类激素激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基形成肽键；与蛋白质或多肽的游离羧基缩合形成肽键甾体甾体：通过含游离羧基的甾体衍生物与载体蛋白相连抗生素抗生素：-内酰胺环在偏碱性条件下可以与蛋白质的自由氨基以酰胺键的形式共价结合；氨基糖苷类抗生素用碳化二亚胺为连接剂实现药物和载体蛋白的连接17优选课堂（1）半抗原和载体结合的化学反应多肽类激素：活化蛋白质或多肽（2）半抗原和）半抗原和载体的体的选择原原则半抗原半抗原：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗体反应的微环境；合理利用分子类似物之间的交叉反应。载体载体：载体对监测系统的影响；载体效应在免疫过程中的影响。18优选课堂（2）半抗原和载体的选择原则半抗原：最好含有芳香结构；应考（3）合成抗原的测定定性测定方法定性测定方法：光谱分析、热力学分析定量测定方法定量测定方法：相对含量测定；绝对含量测定。19优选课堂（3）合成抗原的测定定性测定方法：光谱分析、热力学分析19优一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、三、抗体与免疫反应抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用主要内容主要内容一、概述主要内容免疫分析实际上是一种特殊的试剂分析，特点是抗体成为分析试剂抗体成为分析试剂。21优选课堂21优选课堂1、抗体的结构与功能抗体泛指与待测分子特异性结合的蛋泛指与待测分子特异性结合的蛋白质分子白质分子，包括免疫球蛋白（immunoglobulin）,受体（receptor）和其他结合蛋白质，主要是免疫球蛋白，常用的是IgG分子.22优选课堂1、抗体的结构与功能抗体泛指与待测分子特异性结合的蛋白质分免疫球蛋白的基本结构 IgG分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链是由二硫键连接形成，分为氨基端（N端），羧基端（C端）。23优选课堂免疫球蛋白的基本结构IgG分子基本结构是由四个肽链组成的，抗体的基本结构24优选课堂抗体的基本结构24优选课堂IgG分子由四条多肽链四条多肽链构成，以二硫键相连以二硫键相连，有三个功能区。抗体在Fab区结合抗原分子，同时通过hi区的转动以适应不同距离的抗原决定簇。与抗原结合后，IgG分子构象改变，暴露出Fc上的活性位点，从而表现出固定和激活补体以及粘结单核细胞等亲细胞反应的功能。Fab：抗原结合片段：抗原结合片段Fc：可结晶片段：可结晶片段25优选课堂IgG分子由四条多肽链构成，以二硫键相连，有三个功能区。Fa胃蛋白酶胃蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶巯基乙醇还原巯基乙醇还原巯基乙醇还原巯基乙醇还原26优选课堂胃蛋白酶木瓜蛋白酶巯基乙醇还原26优选课堂胃蛋白酶（pepsin）水解片段 裂解部位，铰链区H链间二硫键（C端）裂解片段，F（ab）2，无Fc片段与抗原结合可发生凝集反应 27优选课堂胃蛋白酶（pepsin）水解片段裂解部位，铰链区H链间二硫木瓜蛋白酶（papain）水解片段 裂解部位，铰链区H链间二硫键（N端）裂 解 片 段，2个 Fab（54KD），一 个Fc（50KD）,Fab与抗原结合，不发生凝集反应。28优选课堂木瓜蛋白酶（papain）水解片段裂解部位，铰链区H链间二2抗体作抗体作为分析分析试剂的的评价价抗体的特异性抗体的特异性是无与伦比的，不需或只需要简单的预处理。有较高的稳定性较高的稳定性。这两点奠定了分析免疫高度灵敏和高度专一的基础。此外，抗体还有一个独特的性质：每个抗体分子有两个抗原的结合点，即多价性。然而抗体缺乏高灵敏试剂应具备的分析信号反差。29优选课堂2抗体作为分析试剂的评价抗体的特异性是无与伦比的，不需或3、抗体的制、抗体的制备（1）常规抗血清（多克隆抗体多克隆抗体）：指人工被动免疫后制成的多克隆抗体，是免疫分析中的重要工具。免疫原的制备、动物免疫、放血、抗血清分离及抗血清的分析鉴定。30优选课堂3、抗体的制备（1）常规抗血清（多克隆抗体）：指人工被动免疫免疫原的制免疫原的制备免疫原由质量好的抗原与佐剂制成。通常有免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度的免疫原。弗氏佐剂是由一定量的羊毛脂和石蜡油，以及一定浓度的分支杆菌混合而成，经研磨达到油包水的程度。不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。31优选课堂免疫原的制备免疫原由质量好的抗原与佐剂制成。通常有免疫原水剂动物免疫物免疫通常的免疫动物为家兔和羊。免疫的部位多采用脚掌、腹股沟淋巴结、大腿肌肉、皮下多点、静脉。免疫抗原量通常为110mg或50100mg。32优选课堂动物免疫通常的免疫动物为家兔和羊。32优选课堂试血及效价血及效价测定定家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量0.5ml。不同稀释度的抗血清和1%的血细胞悬液按1:1混合，37保温2h后观测血细胞的凝聚情况，即可测得免疫血清的效价。33优选课堂试血及效价测定家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量0.5m（2）单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体是建立在经细胞融合而获得的杂交瘤细胞基础上的。所获得的抗体具有均一的特异性。高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞细胞培养法&接种动物体内生产法34优选课堂（2）单克隆抗体单克隆抗体是建立在经细胞融合而获得的杂交瘤细制制备步步骤35优选课堂制备步骤35优选课堂2、抗体的纯化利用化学方法提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白。利用免疫吸附剂和亲和色谱得到免疫学上专一性的抗体。36优选课堂2、抗体的纯化利用化学方法提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白。363、特异性抗体的、特异性抗体的筛选与效价与效价测定定抗体的效价抗体的效价又称滴度，指某一物质与一定容量的另一物质产生反应所需要的量。免疫分析中，免疫血清中抗体的效价指将血清稀释，测定与一定的抗原能发生反应的最大稀释度，此最大稀释度即为血清的效价。常用的效价测定方法有免疫扩散法、间接血凝法和ELISA法等。37优选课堂3、特异性抗体的筛选与效价测定抗体的效价又称滴度，指某一物质一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、四、免疫分析方法及应用免疫分析方法及应用主要内容主要内容一、概述主要内容四、免疫分析方法及其应用四、免疫分析方法及其应用放射免疫分析法（放射免疫分析法（RIA）荧光免疫分析法（荧光免疫分析法（FIA）克隆酶给予体免疫分析法（克隆酶给予体免疫分析法（CEDIA）酶联免疫吸附分析法（酶联免疫吸附分析法（ELISA）四、免疫分析方法及其应用放射免疫分析法（RIA）放射免疫分析法（放射免疫分析法（radioimmunoassay,RIA）1968年年Miles和和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标记抗体作建立了免疫放射分析方法，利用标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其灵敏度比放射免疫示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测量范围也明显扩大。分析法明显提高，而且标准曲线的测量范围也明显扩大。由于特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更快的由于特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更快的发展。近年来，基因工程抗体和抗原应用于本技术，使得免疫放发展。近年来，基因工程抗体和抗原应用于本技术，使得免疫放射分析法更加完善。射分析法更加完善。放射免疫分析（放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是体外放射分析技）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类术中建立最早、应用最广的一类竞争性体外放射分析技术竞争性体外放射分析技术.放射免疫分析法（radioimmunoassay,RIA）基本原理基本原理 基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争原或待测抗原）与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合结合 ,这种竞争可用以下反应式来表示：这种竞争可用以下反应式来表示：抗原抗原 抗体抗体常用的标记物：常用的标记物：125 I和氚标记物和氚标记物放射性活度（贝克，放射性活度（贝克，Bp）1Bp：每秒一次核衰变：每秒一次核衰变比活度（比活度（Bp/g）：）：每单位质量所含的放射性比活度每单位质量所含的放射性比活度游离状态游离状态结合状态结合状态基本原理基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原具体步骤具体步骤 抗原抗体反应结合的和游离的放射性物质的分离放射性活度的测定柱色谱法柱色谱法吸附法吸附法沉淀法沉淀法抗抗体发抗抗体发微孔滤膜法微孔滤膜法固相法固相法求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）具体步骤抗原抗体反应结合的和游离的放射性活度的测定柱色谱法荧光免疫分析法（光免疫分析法（Fluorescence immunoassay,FIA）免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和 敏感性与显微示踪的精确性相结合的一项技术以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原荧光免疫分析法（Fluorescenceimmunoass荧光免疫分析法（光免疫分析法（Fluorescence immunoassay,FIA）在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在的部位在实际工作中，由于荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术荧光免疫分析法（Fluorescenceimmunoass根据实验方法分类直接法间接法补体法其他根据实验方法分类直接法直接法直接法将荧光标记的特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，经一定的温度和时间染色，水洗-干燥-封片-镜检操作简便、特异性高、非特异性染色少敏感性低抗原标记抗体荧光直接法将荧光标记的特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，间接法间接法先用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）与其反应，形成抗原-抗体-抗体复合物，水洗-干燥-封镜-镜检未知抗原未知抗原未标记未标记抗体抗体标记抗标记抗体体荧光荧光间接法先用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的补体法利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光补体补体标记抗标记抗补体抗补体抗体体补体法利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光补时间分辨荧光免疫测定 利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。时间分辨荧光免疫测定利用具有双功能基团结构的螯合剂，基本原理基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将它采用抗原与抗体的特异反应将待测物待测物与酶连接与酶连接，然后通过，然后通过酶与底物产生颜色反应酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（标记物酶标记的抗原或抗体（标记物）酶作用的底物（显色剂酶作用的底物（显色剂）酶联免疫吸附分析法（酶联免疫吸附分析法（ELISA）基本原理酶联免疫吸附分析法（ELISA）第三章-免疫分析法(讲课适用)课件双抗体夹心法，属于非竞争结合测定非竞争结合测定。它是检测抗原最常用ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体固相抗体-抗原抗原-酶标抗体免疫复酶标抗体免疫复合物合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。实验原理实验原理 双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。实验原理双抗体夹心法第三章-免疫分析法(讲课适用)课件酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶为辣根辣根过氧化物氧化物酶酶(horseradish peroxidase,HRP)和碱性磷酸和碱性磷酸酶酶(alkaline phosohatase,AP)。1、HRP催化催化过氧化物的氧化反氧化物的氧化反应。供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波长为492nmTMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 2、AP为磷酸磷酸酯酶酶 一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。DNM-9602GDNM-9602G酶标分析仪酶标分析仪DNM-9602 DNM-9602 标配酶标分析仪标配酶标分析仪 DNM-9602ADNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪酶标分析仪酶标分析仪DNM-9602G酶标分析仪DNM-9602标配酶标分析仪思考题思考题1.论述免疫分析法的定义，主要包括哪些方法？2.半抗原、全抗原、合成抗原、抗体、单克隆抗体的定义？3.什么是抗体的效价？4.常用的抗体包括哪两类？并比较它们的特性。5.论述放射免疫测定法（RIA）与酶联免疫分析法（ELISA）的基本原理与方法步骤56优选课堂思考题1.论述免疫分析法的定义，主要包括哪些方法？56优选