泛发性脓疱型银屑病与HLA课件

泛泛发性性脓疱型疱型银屑病与屑病与HLA-DQBHLA-DQB11等位基因的相关性研究等位基因的相关性研究 研究生研究生研究生研究生 付洪军付洪军付洪军付洪军 导导导导 师师师师 张福仁张福仁张福仁张福仁泛发性脓疱型银屑病与HLA-DQB1等位1 1 前前 言言q定义与分型v在最近新版的Rook教科书中，泛发性脓疱型银屑病(GPP)被定义为银屑病的一种不寻常变型，并以急性、亚急性、偶而慢性的损害上发生无菌性脓疱为中心特征。前言定义与分型2 2q依据临床表现把GPP分为5个亚型。即：v(1)急性泛发型(VonZumbusch型)v(2)妊娠期GPP(IP)v(3)儿童型GPPv(4)环型GPPv(5)局限型GPP(不包括手足)依据临床表现把GPP分为5个亚型。即：3 3q对这种分类中的IP仍有争议:不支持观点：病史、诱因、某些化验室 检查、处理等不同。支持观点：病理表现相似、妊娠可诱发 GPP、都具有HLA-B27 抗原。对这种分类中的IP仍有争议:不支持观点：病史、诱因、某些化4 4q寻常型银屑病(PSV)与 GPP的关系可概括为:v临床表现的包容性，即：二者皮损可共存、转化。v免疫异常的相似形，即：二者皮损处都有CD4+、CD8+T细胞的浸润,IL-6、IL-8高水平表达,白细胞聚集形成微脓肿。v遗传背景的明显差异性(后述)。寻常型银屑病(PSV)与GPP的关系可概括为:5 5q两种临床异质、遗传异质GPP亚型:v有PsV病史的GPP与无PsV病史的GPP。vPsV阳性GPP发病年龄偏晚，诱发因素常是先前的糖皮质激素治疗或不规则撤退。vPsV阴性GPP发病年龄偏早，诱发因素多为上呼吸道感染。v遗传异质性后述。两种临床异质、遗传异质GPP亚型:6 6qHLA复合系统vHLA位与人6上,全长3600Kb,只占整个人类基因组的1/3000,是人类基因组中最复杂的遗传系统。v目前已鉴定出224个基因座位,128个有功能性产物表达,其中39.8%基因产物直接参与免疫应答及调节。因而HLA系统多与免疫性疾病有关。v与疾病关联最密切的一区域，现已肯定50多种疾病与HLA基因明显关联，即 HLA复合体与疾病关联程度超过人类基因组任何一个区域。HLA复合系统7 7vHLA-DQB1位于HLA-II类基因DQ亚区，目前已鉴定的DQB1等位基因达25个，对应的血清特异性抗原只有9种，即25个等位基因编码的抗原只有9种特异性。vDQB1与DQA1分别编码DQ分子的链和链。已发现DQB1等位基因与多种疾病关联。最典型的例子是与IDDM的关联。如果DQ链第57位氨基酸是D，则对IDDM呈抗性；若为D以外的其它氨基酸，则表现为易感性。HLA-DQB1位于HLA-II类基因DQ亚区，目前已鉴定8 8q研究HLA与疾病相关，实质上是研究疾病发生发展的遗传倾向，因而属于病因学研究。q研究方法通常有关联分析和连锁分析。研究HLA与疾病相关，实质上是研究疾病发生发展的遗传倾向，因9 9v关联分析是比较来自同一群体中无亲缘关系的患病个体与非患病个体(对照)在某一遗传标记位点(marker locus)上的特定等位基因(如HLA等位基因)与疾病性状的相关程度。一般通过患病人群和健康人群作HLA分型后，用统计学方法(通常用2-tesf)进行判别，故属于病例对照研究，又称群体相关研究（population association studies）。关联分析是比较来自同一群体中无亲缘关系的患病个体与非患病个体1010v若发现标记位点的特定等位基因频率在患病组与对照组之间有显著性差异，则表明该特定等位基因与所研究的疾病性状相关联，提示标记位点可能含有一个疾病易感基因或与易感基因紧密连锁。关联程度通过计算相对危险度(relative risk,RR)来估计。若发现标记位点的特定等位基因频率在患病组与对照组之间有显著性1111q关联分析结果的判定v发现某种HLA等位基因或抗原与某种疾病关联(有统计学意义)并不意味着携带该基因就一定患病，关联结果有两种可能的解释。v一种可能：关联成分与疾病易感性有关(原发关联)。v另一种可能：关联成分与疾病易感性无关，而仅仅是遗传标记，但由于该基因位点存在与HLA连锁不平衡的其他未知基因，可能也造成机体对疾病易感。关联分析结果的判定1212v如HLA-DQB1*0405在IDDM发病中起关作用，但此基因又与HLA-DRB1*0901及HLA-B*4601呈连锁不平衡，使人误认为HLA-DRB1*0901或HLA-B*4601与疾病关联，实际上只有HLA-DQB1*0405属于该病的原发关联成分，其它2个等位基因属于次级关联。如HLA-DQB1*0405在IDDM发病中起关作用，但此基1313q关联分析的实际意义v关联分析可提示相关位点或特定的等位基因的传递方式及效应性质。如正相关，促发病；负相关，保护不发病。并可由亚型分析发现其遗传异质性(如I型与II型银屑病)。v关联分析虽只能将致病基因粗略地定位于某个位置，却能为以后的基因精确定位、克隆等研究提供重要依据和线索。关联分析的实际意义1414qHLA的分型技术v血清学方法：只能检测HLA基因产物即HLA抗原宽特异性，不能检测HLA基因本身的多态性。v 细胞学方法：由于分型细胞来源困难，且只能检少数HLA-DW、HLA-DPW抗原，现已基本不用。HLA的分型技术1515v分子生物学技术：即DNA水平的HLA分型技术。可检出HLA多态性，可识别同一位点的不同等位基因，随着PCR技术方法的改进和发展，其精度和分辨水平越来越细，有助于深入研究HLA基因的结构和功能。v常用的方法：包括PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)、PCR-SSO(序列特异寡核苷酸探针)、PCR-SSP(序列特异性引物)及PCR-SBT(序列直接分型)等。分子生物学技术：即DNA水平的HLA分型技术。可检出HLA多1616vPCR-SSP基本原理：PCR反应的特异性取决于扩增引物与模板DNA的精确匹配。应用SSP引物使HLA分型特异性转化为由PCR反应特异性来决定，因为SSP引物序列与特异性等位基因的核苷酸序列完全匹配，只要控制好PCR反应条件，就使每对SSP仅能扩增某一特异性HLA等位基因，扩增产物通过琼脂糖电泳或荧光检测，便可测定其特异性，从而达到对HLA等位基因分型的目的；同时反应体系中加入了参照引物，扩增HLA区域内一段保守序列，又可避免假阴性结果。PCR-SSP基本原理：PCR反应的特异性取决于扩增引物与模1717vHLA与银屑病的相关性研究vRussell(1972)首次报道了HLA-B17与银屑病明显相关。v银屑病与HLA的相关已明确，即至少有一个银屑病基因位于HLA位点或在附近。v比较一致的意见认为:PsV与HLA-A1、B13、B17、Cw6、DR7等相关。HLA与银屑病的相关性研究1818vI型银屑病(40岁以前发病)主要表达HLA-Cw6、HLA-B57、HLA-DR7；vII型银屑病(40岁以后发病)则高度表达HLA-Cw2。v最近翟宁等发现HLA-DQB1*0602与东北汉人PsV关。刘涛峰等则发现皖汉人PsV与HLA-DQA1*0201明显相关。I型银屑病(40岁以前发病)主要表达HLA-Cw6、HLA-1919vDausset等(1977)首次报道了GPP与HLA-A13、B17、B27相关后，vKarvonen和Zachariae等随后证实HLA-B27与GPP强相关，与PsV不相关；从而首次揭示了PsV与GPP的遗传背景具有差异性。Dausset等(1977)首次报道了GPP与HLA-A12020vOcklawaha等（1996）对日本541例GPP的流行病学研究发现：vGPP与HLA-A2、B14、B35有弱相关；vPsV阳性的GPP与HLA-A1、B37、DRw10显著相关；PsV阴性的GPP不与它们相关，v从而首次揭示PsV阳性的GPP与PsV阴性的GPP具有遗传异质性。Ocklawaha等（1996）对日本541例GPP的流行2121vOzawa等则首次从DNA水平上研究发现HLA-DQB1*0303与PsV阴性的GPP显著相关。v进一步验证了PsV阳性的GPP与PsV阴性的GPP的遗传异质性。v我国只有宋芳吉报道北方汉族GPP患者与HLA-B13显著相关，v国内尚未有HLA-II基因与GPP相关的研究文献。Ozawa等则首次从DNA水平上研究发现HLA-DQB1*2222目 的本文采用PCR-SSP技术，对山东籍汉人GPP患者和健康对照进行HLA-DQB1等位基因分型研究，目的在于：目的23231)探讨山东汉人GPP与HLA-DQB1等位基因的相关性。从而从DNA水平上探讨GPP可能的发病机制。2)获得山东汉人对GPP易感或保护的相关基因。3)验证PsV阳性GPP与PsV阴性GPP遗传异质性；以及探讨GPP各临床类型的遗传背景是否具有差异性，从而为临床分型提供依据。4)长远目的为研究中国汉人与GPP相关性提供一些遗传学数据。1)探讨山东汉人GPP与HLA-DQB1等位基因的相关性。从2424材料与方法q实验仪器与材料DNA扩增仪稳压电泳仪紫外线分析仪台式高速离心机旋涡混合器移液器(2l，20l，200l各一个)序列特异性引物（SSP）PCR反应 Buffer TaqDNA聚合酶材料与方法实验仪器与材料2525q实验对象v病例资料：38例GPP均来自1990年以来，曾在我院住院治疗(包括多次住院)并确 诊的GPP患者和近2年来门诊新发现并 确诊的GPP患者，所有患者均为山东 籍汉族人，性别、年龄不限。v对照资料：94例全部来自山东中医药大学，山东籍汉族大学生及教职工自愿健康献血员，彼 此 间 无 血 缘 关 系，个 体 及 家 族 中 无 银屑病及其病史。实验对象2626q标本收集：病例及对照每人均采取周围静脉全血2ml，置于含有塑料试管里，稍混匀加盖后，-80超低温冰箱保存。qDNA抽提：应用上海生工提供的抽提试剂盒。标本收集：病例及对照每人均采取周围静脉全血2ml，置于含有塑2727qPCR反应体系：每个PCR反应体系为25l。其中含有10PCR Buffer 2.5ml；0.4 mol特异性引物；0.2 mol内对照引物；200 mol的dNTP mmol MgCl2；1 u Tag DNA酶；2l 模板DNA。qPCR反应参数：第一步94预变性5 min。第二步94 变性30 s55-60退火50 s72延伸30s32个循环。第3步72延伸5min。第4步4保存2 h。PCR反应体系：每个PCR反应体系为25l。其中含有102828q读取及判断结果：每条泳道内必须出现阳性对照带(796bp)，在其前方对应欲检测等位基因大小的位置出现明亮的带时判为阳性；如果未出现阳性对照带，视为PCR反应不成功,需重新扩增。电泳图象，见图-1，-2，-3，-4，读取及判断结果：每条泳道内必须出现阳性对照带(796bp)2929 M DQB1*0603、0201、0602200bp100bpMDQB1*0603、0201、3030M DQBM DQB1 1*0501*0501、0602 0602AC/GPP无PsV史及家族史200bp100bpM3131 M DQB M DQB1 1*0602*0602、0303 0303成人GPP有关节型银屑病史200bp100bpMDQB1*0602、3232 M DQB M DQB1 1*0603*0603、0201 0201 儿童GPPPsV、家族史阳性200bp100bpMDQB1*0603、023333q统计学处理v采用2检验：对患者组与对照组的HLA-DQB1等位基因逐一进行关联分析。应用软件包，把相关数据输入计算机计算出相关参数2、P和RR值。v校正Pc(Pcorrection)由Bonferrn法计算，即PC=P所检测的等位基因数。v以PC作为显著性检验水准。统计学处理3434v等位基因频率(Allelicfrenquency,AF)依据Hardy-Weinberg平衡定律，由公式AF=1-(1-antigenfrequency)1/2计算，其中antigenfrequency为检测阳性数占检测总数的百分数。等位基因频率(Allelicfrenquency,AF)依3535结结 果果q临床情况v一般情况：病例组38例，男26例，女12例。发病年龄最小2月，最大72岁，平均29岁；其中12岁以下发病的儿童8例。病程最短21天，最长30年。PsV病史阳性18例(包括1例关节型银屑病)，PsV病史阴性20例。有PsV家族史9例。对照组94例，男59例，女36例，平均年龄21岁。结果临床情况3636v临床类型：VonZumbusch型27例；LGPP6例；妊娠期GPP3例；AC/GPP2例；8例儿童均为VonZumbush型。v9例做病理检查，表现为角化不全，表皮内中性粒细胞移入，角层下棘层上部Kogoj微脓肿，棘层不同程度的肥厚；真皮浅层血管扩张，周围淋巴细胞、中性粒细胞浸润。临床类型：VonZumbusch型27例；LGPP6例3737q实验结果，见：表1表2表3表4实验结果，见：3838 表表1 GPP患者与对照组患者与对照组 HLA-DQB1等位基因频率分布比较等位基因频率分布比较 等位基因患者组对照组n=38n=942 P PC RR频数频率频数频率DQB1*0602110.157100.055DQB1*0603110.15770.038DQB1*060410.013230.131DQB1*0201150.22270.0386.780.0090.1173.4210.60.0010.0135.068.6740.0030.0390.0819.980.00040.0058.10表1GPP患者与对照组HLA-DQ3939HLA-DQB1等位基因PsV阳性GPP(n=18)对照组(n=94)2 P PC RR频数频率频数频率DQB1*060230.087100.0550.110.4365.6681.68DQB1*060390.29270.03819.000.00040.00512.42DQB1*0201130.47270.03838.910.00040.00532.31表表2 PsV阳性阳性GPP与对照组与对照组 基因频率分布比较基因频率分布比较HLA-DQB1PsV阳性GPP(n=18)对照组(n=94040表表3 PsV阴性阴性GPP与对照组与对照组 基因频率分布比较基因频率分布比较HLA-DQB1等位基因PsV阴性GPP(n=20)对照组(n=94)2 P PC RR频数频率频数频率DQB1*060280.225100.0558.600.0030.0395.60DQB1*060320.05170.0380.000.6578.5411.38DQB1*020120.05170.0380.000.6578.5411.38HLA-DQB1PsV阴性GPP(n=20)对照组(n=94141HLA-DQB1等位基因PsV阳性GPP(n=20)PsV阴性GPP(n=20)2P PC RR频数频率频数频率DQB1*060230.08780.2251.500.1602.080.30DQB1*060390.29220.0517.370.0070.0919.00DQB1*0201130.47220.05115.350.00040.00523.40表表4 PsV 阳性阳性GPP与与PsV 阴性阴性GPP基因频率比较基因频率比较HLA-DQB12PPC4242讨讨 论论q本实验结果显示vHLA-DQB1*0201、0603的频率在患者中显著升高，与对照组比较均有显著性差异(，PC；，PC)。v表明携带DQB1*0201、0603这两个等位基因的山东汉族人群患GPP的风险性高于其他人群。讨论本实验结果显示4343进一步分析：DQB1*0201、0603多呈杂合态表达(9/15，9/11)。而对照组无一例表达。表明杂合体(0201/0603)患GPP的风险性最高。进一步分析：4444vHLA-DQB1*0602的频率患者组较对照组也明显升高(，P=0.009)，但校正后无统计学差异(PC=0.117)。v本研究认为扩大样本量后，可能会出现阳性关联。v依据是：DQB1*0201、0603、0602这3个等位基因编码的DQ分子有共同的结构。HLA-DQB1*0602的频率患者组较对照组也明显升高(，4545v如：Khandnja发现，96%抗dsDNA抗体阳性的SLE患者携带DQB1*0201或DQB1*0602，v随后他发现这2个基因编码的DQ链第14位aa都是甲硫氨酸，第26位都是亮氨酸，而其它DQB1等位基因在这2个位置的氨基酸差异较大。v提示这2个基因编码的抗原分子含有与致病肽结合的共表位。如：Khandnja发现，96%抗dsDNA抗体阳性的SLE4646vHjelmstrom研究发现DQB1*0201、0603与MG强相关。v他采用同源模型技术构建出这2个等位基因编码的DQ2和DQ6分子结构。v提出了P7和P9 2个共同的可能的易感肽链结合区。Hjelmstrom研究发现DQB1*0201、0603与M4747v本实验对3份DQB1*0201阳性的扩增DNA测序结果：v3份扩增DNA碱基序列在第30位都由正常的T变为G。在第45位，2份由T变为G，1份由A变为C。与人类基因库提供的氨基酸序列比对，本实验在第21-23位的氨基酸序列与正常比较差异较大。v我们还不敢判定这些碱基和氨基酸的异常与GPP关系有多大，但至少带给我们一点启示。本实验对3份DQB1*0201阳性的扩增DNA测序结果：4848v本实验显示，患者组中DQB1*0604的频率明显 低 于 对 照 组(，PC0.05)，表 明 携 带DQB1*0604的山东汉人患GPP的风险性较小。v国外研究表明，携带DQB1*0604的白人对MG抵抗。v但DQB*0604是否是山东汉人或国人对GPP抵抗的保护性基因，有待于进一步研究。本实验显示，患者组中DQB1*0604的频率明显低于对照组(4949v通过以上分析，结合本科题研究。v推测：DQB1*0201、0603、0602这3个等位基因编码的DQ2和DQ6分子链中可能存在着与GPP易感的肽链结合区。通过以上分析，结合本科题研究。5050qPsV阳性GPP与对照组比较DQB1*0201、0603的频率在PsV阳性GPP组中显著高于对照组(RR=32.31，PC=0.005；RR=12.42，PC=0.005)。qPsV阴性GPP与对照组比较DQB1*0602频率显著高于对照组(RR=5.6，PC=0.039)。PsV阳性GPP与对照组比较5151qPsV阳性GPP与PsV阴性GPP比较DQB1*0201、0603的频率在PsV阳性GPP组高于PsV阴性组（RR=23.4，PC=0.005；RR=9.0，P=0.007）。通过以上三个比较表明：DQB1*0201、0603与PsV阳性GPP关联；DQB1*0602与PsV阴性GPP关联。q本实验结果强烈支持PsV阳性GPP与PsV阴性GPP具有遗传异质性的观点。q本文还分析了GPP各临床类型DQB1等位基因的分布情况，结果各临床类型之间的差异无统计学意义。PsV阳性GPP与PsV阴性GPP比较5252q本实验结果与日本研究不一致，日本人GPP与DQB1*0303强相关。v根据Nishikai报道，日本人SLE患者中DQB1*03亚群（0301、0302、0303）的频率都升高，推测DQB1*03亚群可能是日本人的优势基因。v所以本实验结果与日本研究不一致，可能与种族不同有关。v但也不能排除与其它等位基因强烈连锁不平衡的结果。本实验结果与日本研究不一致，日本人GPP与DQB1*03035353小小 结结q本研究采用PCR-SSP法，对鲁籍38例GPP和94例健康对照进行了HLA-DQB1等位基因分型研究，发现HLA-DQB1*0201、0603与GPP患者显著相关，提示HLA-DQB1*0201、0603可能是山东汉人GPP的易感基因。有PsV病史的GPP与无PsV病史的GPP与HLA-DQB1相关的等位基因不同，表明这两种类型GPP的遗传背景具有差异性。本研究提供了一些中国汉人与GPP相关的遗传学数据，这对于今后研究中国汉人与GPP的相关性具有重要意义。小结本研究采用PCR-SSP法，对鲁籍38例G5454展展 望望q本实验没有对其它HLA位点等位基因进行分型研究，因而无法推测山东汉人对GPP易感或保护的单体型。qHLA各等位基因座位之间存在广泛连锁，有些基因连锁后易感性消失，有些反而增强，因而推断与疾病相关的单体型，比研究单个等位基因与疾病的相关性更有助于阐明疾病的病因及发病机制。展望本实验没有对其它HLA位点等位基因进行分型5555q由此可见，研究中国汉人与GPP的相关性，重点研究与GPP相关的单体型以及分析关联基因所编码的分子结构将是以后研究的方向。由此可见，研究中国汉人与GPP的相关性，重点研究与GPP相关5656Thankyouforattending!5757