无菌工艺和验证-(NXPowerLite)课件

无菌原料药工艺、验证和申报无菌原料药工艺、验证和申报 GMP、质量质量（基于中国新版（基于中国新版GMP要求要求）2009.10.242SFDA 2009年年10月发布新版月发布新版GMP草稿并开始征求业草稿并开始征求业界意见，据悉可能在明年初正式发布，给企业一到界意见，据悉可能在明年初正式发布，给企业一到两年的整改时间。两年的整改时间。起草专家小组确定参照欧盟版本进行修订，已完成起草专家小组确定参照欧盟版本进行修订，已完成GMP通则和无菌药品、中药制剂、原料药、血液制通则和无菌药品、中药制剂、原料药、血液制品、生物制品附录的修订品、生物制品附录的修订大部分非最终灭菌产品的企业面临新一轮的厂房改大部分非最终灭菌产品的企业面临新一轮的厂房改造和设备更新。造和设备更新。新版新版中国中国GMP的修的修订动态3欧盟欧盟1999年年8月正式开始执行灭菌方法月正式开始执行灭菌方法选择的决策树选择的决策树决策树的作用是在考虑各种复杂因素的决策树的作用是在考虑各种复杂因素的情况下辅助选择最佳的灭菌方法情况下辅助选择最佳的灭菌方法欧盟欧盟灭菌方法菌方法选择的的对策策4溶液溶液剂型型产品品灭菌方法菌方法选择的决策的决策树产品是否可以在产品是否可以在121121湿热灭菌湿热灭菌1515分钟分钟产品是否可以湿热灭菌产品是否可以湿热灭菌F F0 08 8 分分钟，达到钟，达到SAL SAL 1010-6-6采用高压灭菌锅采用高压灭菌锅 1211512115分钟分钟是是否否处方是否可以通过微生物滞留过处方是否可以通过微生物滞留过滤器过滤滤器过滤无菌配药和灌封无菌配药和灌封 采用湿热灭菌采用湿热灭菌 F08 F08 分钟分钟除菌过滤和无菌工艺相除菌过滤和无菌工艺相结合结合是是否否是是否否5非溶液非溶液剂型、半固体或干粉型、半固体或干粉产品品灭菌方法菌方法选择的决策的决策树产品是否可以在产品是否可以在160160干热灭菌干热灭菌120120分钟分钟产品是否可以在另外一种时间和温度条件产品是否可以在另外一种时间和温度条件下标准周期干热灭菌达到下标准周期干热灭菌达到SAL SAL 1010-6-6采用采用160160干热灭菌干热灭菌120120分钟分钟是是否否产品是否可以用其他非干热方法灭菌，如产品是否可以用其他非干热方法灭菌，如电离辐射，吸收最小剂量电离辐射，吸收最小剂量 25KGY25KGY采用另一种替代时间和温度条件下采用另一种替代时间和温度条件下标准周期干热灭菌达到标准周期干热灭菌达到SAL SAL 1010-6-6是是否否产品是否可以使用经过验证的稍低辐射剂产品是否可以使用经过验证的稍低辐射剂量灭菌（参见量灭菌（参见ISO11137ISO11137）采用最小辐射吸收最小剂量采用最小辐射吸收最小剂量 25KGY25KGY进行辐射灭菌进行辐射灭菌是是否否处方是否可以通过微生物滞留过滤器过滤处方是否可以通过微生物滞留过滤器过滤采用经过验证的辐射剂量灭菌采用经过验证的辐射剂量灭菌是是否否无菌配药和灌封无菌配药和灌封除菌过滤和无菌工艺相结合除菌过滤和无菌工艺相结合是是否否决策树越往下，风险越大，需要提供的必要证据越多！决策树越往下，风险越大，需要提供的必要证据越多！6除菌除菌过滤系系统的的选择和和验证除菌除菌过滤系系统的的选择应考考虑工工艺特性特性所要求的流量、所要求的所要求的流量、所要求的压差差可使用的可使用的灭菌方法菌方法过滤介介质的寿命（的寿命（灭菌次数、使用菌次数、使用时间）过滤器器结构：筒式，平板式构：筒式，平板式无菌无菌过滤是截留微生物，因此具有一定的是截留微生物，因此具有一定的风险除菌能力和挑除菌能力和挑战（Bacteria Challenge Testing）制造制造过程中的不均一性程中的不均一性药液液对过滤介介质的化学相容性（的化学相容性（Chemical Compatibility）析出物（析出物（Extractable levels）颗粒脱落（粒脱落（Particle Shedding）吸附（例如：吸附（例如：药液灌装因液灌装因为吸附活性成分吸附活性成分导致初始含量偏低）致初始含量偏低）无菌原料无菌原料药过滤除菌后的除菌后的结晶干燥包装工序不会受到影响，但晶干燥包装工序不会受到影响，但验证方方案中要案中要说明明为什么不考什么不考虑吸附吸附验证的理由。的理由。7除菌除菌过滤器器验证项目目 生物性能生物性能微生物截留微生物截留客户定制客户定制流速流速产量产量操作温度操作温度压力压力系统尺寸大小系统尺寸大小 物理性能物理性能完整性完整性产品水起泡点产品水起泡点扩散流扩散流吸附吸附颗粒脱落颗粒脱落 化学性能化学性能相容性相容性析出物析出物验证必须是以产品为介质，在最差的条件下进行验证必须是以产品为介质，在最差的条件下进行8化学相容性化学相容性测试方法方法证明明过滤介介质不会把外来物不会把外来物质带进产品品证明无菌明无菌过滤介介质不受不受产品的影响，削弱它的品的影响，削弱它的强度和完度和完整性整性测试包括：包括：可氧化物可氧化物质（用水（用水为溶溶剂时可以分析可以分析TOC）析出物分析：如溶析出物分析：如溶剂中的不中的不挥发物（物（NVR-Non Volatile Residue）、水溶液）、水溶液pH、电导率、溶率、溶剂浓缩100倍后色倍后色谱分析、分析、可可选的的GC-Mass/GPC/FT-IR/HPCE/SFC分析分析吸附分析（不涉及无菌原料吸附分析（不涉及无菌原料药）颗粒脱落分析（不溶性微粒粒脱落分析（不溶性微粒药典分析）典分析）完整性完整性试验（使用前后起泡点（使用前后起泡点变化）化）流量流量变化化外外观物理物理变化化使用前后生物截留能力使用前后生物截留能力变化（化（Media fill时将将过滤器最器最长使用使用时间、最多、最多灭菌次数作菌次数作为最差条件考最差条件考虑）9赛多利斯相容性多利斯相容性测试实例例10赛多利斯析出物多利斯析出物质分析指分析指导11破坏性方法破坏性方法:滤芯生产厂家采用滤芯生产厂家采用细菌挑战性试验细菌挑战性试验(根据根据 HIMA)HIMA)除菌过滤器完整性测试方法除菌过滤器完整性测试方法非破坏性方法非破坏性方法:滤芯用户使用：在过滤前滤芯用户使用：在过滤前 和过滤后检测除菌滤芯和过滤后检测除菌滤芯泡点法泡点法扩散流法扩散流法水侵入法水侵入法(WIT)(WIT)将微生物挑战试验的结果与完整性测试相结合将微生物挑战试验的结果与完整性测试相结合首先证实除菌过滤器对微生物的截留能力首先证实除菌过滤器对微生物的截留能力提供制造商和用户一个非破坏性的方法来取代破坏性的微生物挑提供制造商和用户一个非破坏性的方法来取代破坏性的微生物挑战测试战测试过滤器供应商在提供除菌滤芯时，应提供该滤芯的完整性测试压力、最大过滤器供应商在提供除菌滤芯时，应提供该滤芯的完整性测试压力、最大扩散流值、最大压力衰减值或最小起泡点值。这些物理值是与纯水和材质扩散流值、最大压力衰减值或最小起泡点值。这些物理值是与纯水和材质(膜膜)之间的表面张力、黏度、界面夹角等有关，并通过非破坏性完整性测之间的表面张力、黏度、界面夹角等有关，并通过非破坏性完整性测试与细菌挑战性测试的关联实验，得出的安全数据，并出具相关的认证报试与细菌挑战性测试的关联实验，得出的安全数据，并出具相关的认证报告及实验数据。告及实验数据。12缺陷假缺陷假单胞菌单胞菌无菌水无菌水无菌检验用过滤器无菌检验用过滤器 107 CFU/cm有效过滤面积有效过滤面积混合混合泵破坏性方法：破坏性方法：细菌挑战性试验细菌挑战性试验美国美国HIMA(健康工业生产管理局健康工业生产管理局)规定，在不低于规定，在不低于2 bar的工作压力下，每平方厘米滤膜的工作压力下，每平方厘米滤膜表面能截留均匀分布的缺陷型假单胞菌表面能截留均匀分布的缺陷型假单胞菌10107 7 以上，并以以上，并以LRV（Log Reduce Value）值表示）值表示其截留能力。其截留能力。LRV=log10(过滤前细菌数过滤前细菌数/过滤后细菌数过滤后细菌数)例如：例如：10英寸，英寸，0.2um滤芯，缺陷型假单胞菌挑战，其过滤面积滤芯，缺陷型假单胞菌挑战，其过滤面积=600 cm2挑战菌数：挑战菌数：9.11x1012单位面积挑战菌数：单位面积挑战菌数：1.5 x1010 cm2穿透菌数穿透菌数=1=1LRV=log10(9.11x10 12/1)=12.96 7 Pass!(HIMA规定规定LRV=7为合格为合格)模拟实际工艺的压力流量等参数模拟实际工艺的压力流量等参数步骤步骤确认过滤器的完整性确认过滤器的完整性用含一定数量细菌的培养基过滤用含一定数量细菌的培养基过滤滤过液进行培养（取样后膜过滤滤过液进行培养（取样后膜过滤培养基），培养基），3737度度1414天天过滤后进行完整性测试过滤后进行完整性测试连续验证连续验证3 3次，都应无菌生长次，都应无菌生长13 107 CFU/cm20.6-1.0 m0.3-0.4 m最差测试条件最差测试条件缺陷型假单胞菌缺陷型假单胞菌(ATTC 19146)Brevundimonas Diminuta细菌挑战性试验细菌挑战性试验14几个需要特几个需要特别关注的关关注的关键点点起泡点起泡点标准的建立与截留率的相关性准的建立与截留率的相关性过滤器的微生物截留器的微生物截留验证必必须在在药液中液中进行行在在实际的生的生产参数下参数下进行行验证，如，如压差最高差最高值微生物挑微生物挑战试验和化学相容性和化学相容性试验，不，不强制要求制要求过滤器用器用户自己自己验证，如果，如果过滤器厂家能提供在器厂家能提供在类同条件同条件下下测试的的验证报告和数据，也是可以接受的。告和数据，也是可以接受的。15除菌除菌过滤器的完整性器的完整性测试仪器器膜膜过滤器在使用前器在使用前应进行完整性行完整性测试，在在过滤完成后也完成后也应该测试，以保，以保证整个整个过滤装置在装置在过滤过程中保持完整。程中保持完整。经典方法如：起泡点、典方法如：起泡点、扩散流、散流、稳压测试和前和前进流流测试。这些些测试方法方法应与与细菌截留能力相关菌截留能力相关联。16润湿的滤膜润湿的滤膜压缩空气压缩空气空气优先穿透最大的孔空气优先穿透最大的孔压缩空气压缩空气膜孔类似毛细管膜孔类似毛细管起泡点测试原理起泡点测试原理17产生连续气泡产生连续气泡起泡点如起泡点如CA,0.2 m,3.2bar 起泡点测试（手动方法示意）起泡点测试（手动方法示意）手动方法测试需要在下游端连接管路而影响无菌度手动方法测试需要在下游端连接管路而影响无菌度,因此不推荐手动方法！因此不推荐手动方法！自动完整性测试仪在过滤系统的上游进行测试，避免了下游污染的缺点自动完整性测试仪在过滤系统的上游进行测试，避免了下游污染的缺点现在产生连续的现在产生连续的气泡了吗？气泡了吗？使用手动方法进行气泡点测试时使用手动方法进行气泡点测试时,会因操作者的不同判断产生主观误差。会因操作者的不同判断产生主观误差。18亨利定律亨利定律 Law:气体在液体中的溶解度与压力成正比气体在液体中的溶解度与压力成正比大气压：在润大气压：在润湿介质中溶解湿介质中溶解性较差性较差测试压力：测试压力：2.5 bar在润湿介质中有良好在润湿介质中有良好的溶解性的溶解性扩散流测试原理（扩散流测试原理（1）19最大允许扩散流最大允许扩散流for 0.2 m2:5ml/min测试压力测试压力:2.5 bar forSartobran P Capsule,CA,0.2 m压缩空气压缩空气:扩散流测试原理（扩散流测试原理（2）21扩散流是压缩空气每分钟通过膜孔液体的分子流，扩散流是压缩空气每分钟通过膜孔液体的分子流，它由以下因素决定：它由以下因素决定：气气-液体系、压差、气液接触面积和滤膜的厚度液体系、压差、气液接触面积和滤膜的厚度扩散流测试与微生物挑战结果相对应：扩散流测试与微生物挑战结果相对应：e.g.2.5 bar，Sartobran P,10,0,2 m(CA),最大允许扩散流最大允许扩散流15 ml/min 适于囊式和标准滤芯和大系统测试适于囊式和标准滤芯和大系统测试扩散流测试小结扩散流测试小结22水压缩空气压缩空气连接到完整性测试仪连接到完整性测试仪水V2V1Pinlet=2.5 bar10 min稳定稳定 10 min 测试测试Sartofluor GA 10,0.2 m，允许最大侵入允许最大侵入13 ml/10min压缩空气压缩空气疏水式过滤器水侵入测试疏水式过滤器水侵入测试(WIT)原理原理测试在低于水穿透测试在低于水穿透点的压力下进行点的压力下进行Water intrusion testWater intrusion test23水水空气空气孔越小，侵入就越少。孔越小，侵入就越少。最大的侵入发生在最大最大的侵入发生在最大的孔。的孔。如果孔径如果孔径 “太大太大“,水水就会穿透过去。就会穿透过去。侵入速度侵入速度(ml/min)=p(mbar)侵入体积侵入体积(ml)测试时间测试时间(min)大气压大气压(mbar)水侵入的极限值与微生物挑战测试水侵入的极限值与微生物挑战测试(HIMA)HIMA)的结果直接相关。的结果直接相关。疏水式过滤器水侵入测试疏水式过滤器水侵入测试(WIT)原理原理24在线测试，不污染下游在线测试，不污染下游可以在蒸汽灭菌后进行可以在蒸汽灭菌后进行只使用水，不含只使用水，不含DOP或溶剂等污染物或溶剂等污染物同时检测滤芯的疏水性同时检测滤芯的疏水性同时检测滤芯安装的正确性同时检测滤芯安装的正确性水侵入测试水侵入测试(WIT)优点优点25除菌除菌过滤进行无菌生行无菌生产的典型的典型设备无菌无菌过滤的的组成：成：产品品过滤器、无菌容器、呼吸器、无菌容器、呼吸过滤器器26除菌除菌过滤器的器的SIP和完整性和完整性测试除菌除菌过滤器器SIP和冷却干燥和冷却干燥除菌过滤器完整性测试除菌过滤器完整性测试27带呼吸器无菌容器的呼吸器无菌容器的SIP通用流程：通用流程：进汽排气汽排气灭菌菌进气排汽气排汽冷却干燥冷却干燥保保压备用用“进汽汽”是指通入蒸汽，是指通入蒸汽，“排气排气”则是利用是利用进入的蒸汽来入的蒸汽来驱除系除系统内存在的空气。注意两内存在的空气。注意两个个“汽汽”与与“气气”的区的区别，“汽汽”指水蒸汽，而指水蒸汽，而“气气”则指空气；指空气；“灭菌菌”是通入足是通入足够压力的蒸汽来升温保力的蒸汽来升温保压（也即保温）的（也即保温）的过程；程；“进气排汽气排汽”，则是通入是通入压缩空气或氮气来空气或氮气来驱除系除系统内的存在的水蒸汽；内的存在的水蒸汽；“冷却干燥冷却干燥”是利用通入的氮气或是利用通入的氮气或压缩空气来空气来对系系统进行冷却干燥；行冷却干燥；“保保压备用用”是系是系统应保持一定的正保持一定的正压，因，因为只有正只有正压之下才能之下才能维持系持系统的无菌状的无菌状态。28CIP、SIP管理和管理和验证的重点的重点管理措施管理措施CIP清洗清洗验证关注：最差点取关注：最差点取样、冲洗水、冲洗水TOC/pH、活、活性物料、性物料、辅料、清洗料、清洗剂的残留。的残留。由由计算机控制关算机控制关键参数：水温，清参数：水温，清洁剂浓度，流速，度，流速，时间，阀门的开的开闭，蒸汽温度，蒸汽温度，压力等。力等。SIP蒸汽蒸汽验证关注：根据温度分布关注：根据温度分布验证，选最冷点安装最冷点安装探探头监测温度，温度，灭菌温度菌温度/时间、使用生物指示、使用生物指示剂。实时记录CIP和和SIP的关的关键运行曲运行曲线（温度、温度、压力、力、时间等最好自等最好自动记录）。根据根据验证结果，制果，制订SOP详细规定各种生定各种生产计划模式划模式下下CIP、SIP的周期与有效期。的周期与有效期。29疏水性呼吸疏水性呼吸过滤器完整性器完整性测试完整性完整性测试使用水侵入法使用水侵入法WIT测试通用流程：放空卸通用流程：放空卸压进液液润湿湿测试排排放放保保压备用（或用（或继续使用）使用）“放空卸放空卸压”是是为了了让系系统与外界与外界压力平衡，力平衡，以便下一步的以便下一步的“进液液润湿湿”操作；操作；“进液液润湿湿”则是使是使滤芯浸芯浸润，这是是进行完行完整性整性测试前的必要准前的必要准备；“测试”，以，以规定的定的仪器按一定参数条件操器按一定参数条件操作，作，获得相得相应期望的可靠性期望的可靠性结果；果；“排放排放”，使充，使充满在在过滤系系统里的液体排出；里的液体排出；“保保压备用用”（或（或继续使用），使用），测试通通过暂时不用不用时需保需保压备用，若用，若继续生生产则可投入可投入使用。使用。30典型无菌生典型无菌生产技技术在无菌生在无菌生产过程中，程中，严格地要求将格地要求将产品和生品和生产人人员隔离开来。隔离开来。这一点同一点同样也适用于也适用于药物有效成分的生物有效成分的生产加工，因加工，因为这些成分会危些成分会危害人害人们的健康和周的健康和周围环境。境。尽管今天的尽管今天的GMP药品生品生产质量管理量管理规范范对医医药产品生品生产的的环境和境和设备都提出了很高的都提出了很高的卫生和清生和清洁要求，但是一般都没有要求，但是一般都没有规定如何定如何实现这些要求。些要求。在在选择药品的无菌生品的无菌生产方案方案时，通常都从，通常都从药品的生品的生产技技术规范、范、超超净室方案的室方案的费用高低、需要用高低、需要满足的足的严格格规定和潜在危害的定和潜在危害的级别等几个方面等几个方面进行比行比较和和对比，最比，最终找出一个最佳的技找出一个最佳的技术方案。在方案。在涉及到无菌生涉及到无菌生产时，一般情况下有三种不同的技，一般情况下有三种不同的技术方案可供方案可供选用。用。从从传统的超的超净室技室技术，然后是，然后是RABS(Restricted Access Barrier Systems)隔离装置，最后是隔离室技隔离装置，最后是隔离室技术。这些系些系统都不同程度的都不同程度的满足了无菌生足了无菌生产的要求，如的要求，如对毒性毒性药品的品的控制、控制、卫生消毒生消毒结果的保果的保护、操作者与医、操作者与医药产品隔离等。品隔离等。三种工三种工艺技技术的研的研发历程也从一个程也从一个侧面反映了医面反映了医药产品生品生产自自动化程度的提高，例如化程度的提高，例如CIP/SIP就地清洗和就地就地清洗和就地灭菌系菌系统、满足足VHP的的净化系化系统、自、自动灌装和自灌装和自动清空系清空系统以及集成式的浮游菌以及集成式的浮游菌采采样器器/尘埃粒子埃粒子检测器等等都反映了无菌隔离技器等等都反映了无菌隔离技术和自和自动化技化技术的的进步。步。31典型无菌隔离技典型无菌隔离技术最高的安全保最高的安全保护：隔离室：隔离室隔离室系隔离室系统根据具体工作的任根据具体工作的任务不同，既可以形成正不同，既可以形成正压环境，也可境，也可以生成以生成负压环境（境（对产品和人品和人员的保的保护）。而）。而这一系一系统的最大特点的最大特点在于排除在于排除污染物染物时没有很高的没有很高的时间耗耗费和和费用支出。所有的生用支出。所有的生产操操作都是通作都是通过隔离手套完成的，在生隔离手套完成的，在生产过程中不可能打开隔离室的程中不可能打开隔离室的门。但隔离室系但隔离室系统的使用的使用对操作人操作人员的素的素质要求很高，因此，人要求很高，因此，人员培培训和和资格格审核占用的核占用的费用用较高。高。图图1 隔离室：隔离室：隔离室内部的隔离器达到了环境空气隔离室内部的隔离器达到了环境空气质量质量100级（级（ISO 5/A级）的水平。级）的水平。周围环境的空气质量等级达到了周围环境的空气质量等级达到了ISO8级（级（D级）。级）。隔离室系统有自己的温度和湿度调节隔离室系统有自己的温度和湿度调节系统，有自己的压力调节装置。因此系统，有自己的压力调节装置。因此可以根据不同的医药产品生产任务在可以根据不同的医药产品生产任务在各个隔离室工作间中形成不同的工作各个隔离室工作间中形成不同的工作压力等级（实现对人员和产品的保护）。压力等级（实现对人员和产品的保护）。32典型无菌隔离技典型无菌隔离技术图图2 被动式被动式cRABS隔离装置：隔离装置：层流空气层的等级为层流空气层的等级为100（ISO 5/A级）级）。环境空气质量等级到达了环境空气质量等级到达了10，000（ISO 7/C级）。级）。这种被动式的这种被动式的cRABS隔离装置配备有隔离装置配备有中央中央HVAC设备。生产过程中百分之百设备。生产过程中百分之百前级过滤的循环空气可随时进行循环空前级过滤的循环空气可随时进行循环空气道的清洁、并能保证更换过滤器滤芯气道的清洁、并能保证更换过滤器滤芯时不产生交叉污染。可通过隔离手套介时不产生交叉污染。可通过隔离手套介入工作区的生产操作。入工作区的生产操作。33典型无菌隔离技典型无菌隔离技术图图3 被动式被动式RABS隔离装置：隔离装置：环境空气质量等级到达了环境空气质量等级到达了10000（ISO 7/C级）级的标准。级）级的标准。医药产品生产设备由环境空气质量等医药产品生产设备由环境空气质量等级级100（ISO 5/A级）级的层流空气级）级的层流空气幕隔离起来。幕隔离起来。系统配备有中央系统配备有中央HVAC装置。隔离空装置。隔离空气从医药产品生产机床工作台的高度气从医药产品生产机床工作台的高度进入室内。可通过隔离手套介入工作进入室内。可通过隔离手套介入工作区进行生产操作。区进行生产操作。34典型无菌隔离技典型无菌隔离技术图图4 主动式主动式RABS隔离装置：隔离装置：通过合适的通过合适的100（ISO 5/A级）级的级）级的循环空气装置保证了循环空气装置保证了RABS隔离装置内隔离装置内部层流空气气幕，结合使用隔离防护部层流空气气幕，结合使用隔离防护罩可以构成一个完整的系统。输入的罩可以构成一个完整的系统。输入的空气直接取自室内，进入机床的空气空气直接取自室内，进入机床的空气高度与机床工作台同高。高度与机床工作台同高。RABS隔离装隔离装置环境中的环境等级到达了置环境中的环境等级到达了10000（ISO 7/C级）级，可通过隔级）级，可通过隔离手套介入生产设备的操作。离手套介入生产设备的操作。35典型无菌隔离技典型无菌隔离技术图图5 主动式主动式cRABS隔离装置：隔离装置：通过使用等级为通过使用等级为100（ISO 5/A级）级级）级的循环空气设备保证了层流空气气幕，的循环空气设备保证了层流空气气幕，输入的空气直接取自输入的空气直接取自RABS隔离装置内。隔离装置内。可随时进行循环空气道的清洁、并能保可随时进行循环空气道的清洁、并能保证更换过滤器滤芯时不产生交叉污染。证更换过滤器滤芯时不产生交叉污染。机床隔离防护罩与循环空气设备构成了机床隔离防护罩与循环空气设备构成了等级为等级为10000（ISO 7/C级）级的整级）级的整体环境空气质量。可通过隔离手套介入体环境空气质量。可通过隔离手套介入工作区的生产操作。工作区的生产操作。36典型无菌隔离技典型无菌隔离技术图图5 主动式主动式cRABS隔离装置：隔离装置：通过使用等级为通过使用等级为100（ISO 5/A级）级级）级的循环空气设备保证了层流空气气幕，的循环空气设备保证了层流空气气幕，输入的空气直接取自输入的空气直接取自RABS隔离装置内。隔离装置内。可随时进行循环空气道的清洁、并能保可随时进行循环空气道的清洁、并能保证更换过滤器滤芯时不产生交叉污染。证更换过滤器滤芯时不产生交叉污染。机床隔离防护罩与循环空气设备构成了机床隔离防护罩与循环空气设备构成了等级为等级为10000（ISO 7/C级）级的整级）级的整体环境空气质量。可通过隔离手套介入体环境空气质量。可通过隔离手套介入工作区的生产操作。工作区的生产操作。37典型无菌隔离生典型无菌隔离生产线38无菌隔离器技无菌隔离器技术（无菌（无菌进入和入和传递）采用采用Alpha/Beta接口接口进行行无菌无菌传递连接干接干/湿湿热灭菌器菌器连接化学接化学灭菌气菌气锁（使用（使用VHP、环氧乙氧乙烷、甲、甲醛、臭、臭氧氧灭菌）菌）39无菌隔离器不同的人无菌隔离器不同的人员介入方式介入方式手套手套/套袖套袖0.5m介入介入半身衣（半身衣（1.2m介入距离）介入距离）全身衣全身衣无限制介入无限制介入40无菌隔离器使用无菌隔离器使用VHP进行行SIP灭菌菌由于由于环氧乙氧乙烷、甲、甲醛、过氧乙酸熏蒸存在毒性大、氧乙酸熏蒸存在毒性大、监测残留、腐残留、腐蚀设备仪器表面等器表面等诸多多问题，现在已在已经基本不基本不为业界所采用。界所采用。臭氧熏蒸也因臭氧熏蒸也因为不能不能杀灭孢子的子的缘故也只限于日常消毒使用，不故也只限于日常消毒使用，不被法被法规认可作可作为灭菌方法使用。菌方法使用。VHPVapour Hydrogen Peroxide 汽化汽化过氧化氧化氢则因因为毒性毒性小、小、对设备仪器腐器腐蚀性、能性、能杀灭孢子，被子，被业界推荐作界推荐作为无菌隔离无菌隔离器的器的SIP灭菌手段。菌手段。灭菌菌验证通常采用生物指示通常采用生物指示剂：枯草杆菌芽：枯草杆菌芽孢 孢子条子条41无菌隔离器的无菌隔离器的验证-检漏漏试验无菌隔离器的无菌隔离器的检漏可以有两种：漏可以有两种：痕量气体（氨、氦）的泄漏痕量气体（氨、氦）的泄漏监测。保保压试验（一般正（一般正压15Pa或以上），如果封或以上），如果封闭手套箱的各个手套箱的各个进出接出接口，一般来口，一般来讲0.5%以下的以下的总容容积泄漏是可以接受的。泄漏是可以接受的。隔离器安装后隔离器安装后OQ应包括包括检漏漏试验，因，因为在运在运输过程中密封程中密封有可能遭到破坏。当然一般隔离器都可能会安装欠有可能遭到破坏。当然一般隔离器都可能会安装欠压、过压控制和控制和报警装置。警装置。另外要注意的是：通常气体熏蒸另外要注意的是：通常气体熏蒸灭菌通常都是有毒的，因此菌通常都是有毒的，因此检漏漏试验应该作作为日常日常监控的一部分。控的一部分。如果隔离器不完全密封，留有鼠洞式如果隔离器不完全密封，留有鼠洞式产品出口，除了品出口，除了维持正持正压外，外，还需要用需要用发烟和烟和录像来像来证明气流的可靠和无菌保障。明气流的可靠和无菌保障。42无菌隔离器的无菌隔离器的验证-手套手套检漏漏试验由于担心手套的破由于担心手套的破损导致无菌隔离失效，除了致无菌隔离失效，除了要求手套每次用前必要求手套每次用前必须进行外行外观检漏和及漏和及时更更换，业界界还开开发出多种出多种专用手套用手套/套袖套袖检漏漏仪，以以检查难以目以目检发现的的针孔。孔。43生生产环境控制境控制尘埃微粒埃微粒监控控欧盟欧盟GMPGMP要求：要求：应对A A级区区的的空空气气粒粒子子进行行连续测定定。A A级区区和和B B级区区空空气气总的的采采样量量不不得得少少于于1 1米米3 3，C C级区区最最好好也也能能达达到到此此标准准。（采采用用多多点点固固定定安安装大流量装大流量28.3L/min28.3L/min尘埃粒子埃粒子计数器探数器探头组网）网）洁净度度级别悬浮粒子最大允浮粒子最大允许数数/立方米立方米静静态动态0.5m0.5m5m5m0.5m0.5m5m5mA A级352035202020352035202020B B级35203520292935200035200029002900C C级352,000352,000290029002900029000D D级2900029000不作不作规定定不作不作规定定44生生产环境控制境控制尘埃微粒埃微粒监控控中国新版中国新版GMPGMP草案要求：草案要求：应对A A级区区“动态”的的悬浮浮粒粒子子进行行频繁繁测定定，并并建建议对B B级区区“动态”也也进行行频繁繁测定。定。A A级区区和和B B级区区空空气气总的的采采样量量不不得得少少于于1 1米米3 3，C C级区区也也宜宜达达到到此此标准。（采用便携式大流量准。（采用便携式大流量尘埃粒子埃粒子计数器数器28.3L/min28.3L/min）洁净度度级别悬浮粒子最大允浮粒子最大允许数数/立方米立方米静静态动态0.5m0.5m 5m5m0.5m0.5m5m5mA A级350035001 1350035001 1B B级350035001 135000035000020002000C C级350000350000200020002000020000D D级2,00002,0000不作不作规定定不作不作规定定45生生产环境控制微生物采境控制微生物采样中国新版中国新版GMPGMP草案和欧盟草案和欧盟GMPGMP要求：要求：A A级级区区和和B B级级区区空空气气总总的的浮浮游游菌菌采采样样量量不不得得少少于于1 1米米3 3。C C级级区区也也宜宜达达到到此标准。此标准。微生物微生物污染限度参考染限度参考标准准(中国中国/欧盟欧盟)级别空气空气样cfu/mcfu/m3 3沉降碟沉降碟(90mm90mm)cfu/4cfu/4小小时(b)(b)接触碟接触碟(55mm55mm)cfu/cfu/碟碟5 5指手套指手套cfu/cfu/手套手套A A 1 1 1 1 1 1 1 1B B10105 55 55 5C C10010050502525D D200200100100505046无菌无菌检查无菌原料无菌原料药常用薄膜常用薄膜过滤法：不适用于无法溶法：不适用于无法溶解的解的样品，如无菌衣或品，如无菌衣或肠线。大体大体积检验量，不存在稀量，不存在稀释培养基培养基问题。样品中的抑菌因素可被品中的抑菌因素可被滤除，中和除，中和试剂可可应用用在淋洗液中，如：在淋洗液中，如：-内内酰胺胺酶。不必再培养，因此不必再培养，因此检验周期确定。周期确定。大大样品品检验量不增加培养基。量不增加培养基。通常是封通常是封闭系系统，如，如STERITEST，降低，降低污染染可能性。可能性。培养基培养基较清澈，易清澈，易观察生察生长情况。情况。工作工作环境：境：100级无菌隔离系无菌隔离系统中中进行。行。两种微生物培养基：两种微生物培养基：用于真菌培养的改良用于真菌培养的改良马丁培养基，培养温丁培养基，培养温度：度：23-28。用于用于厌氧和需氧氧和需氧细菌培养的硫乙醇酸菌培养的硫乙醇酸盐流流体培养基，培养温度：体培养基，培养温度：30-35。47无菌无菌检查参考参考资料料无菌无菌检查微生物限度微生物限度检查操作光操作光盘（上、下集）（中（上、下集）（中检所所录制）制）48无菌生无菌生产包装工包装工艺的的验证过滤系系统的的验证空空调系系统、无菌隔离器的、无菌隔离器的验证环境境监控和无菌控和无菌环境境验证灭菌菌验证（气体熏蒸和其他（气体熏蒸和其他SIP）无菌无菌检验方法方法验证培养基灌培养基灌封封（Media Fill）试验包装容器密封性包装容器密封性验证49培养基灌培养基灌封封（Media Fill）试验使用培养基模使用培养基模拟药品品进行无菌灌封，行无菌灌封，对无菌工无菌工艺进行行验证。又称。又称为“工工艺模模拟试验”(Process simulation).将培养基暴露于将培养基暴露于设备、容器、密封系、容器、密封系统的表面和关的表面和关键环境条件中，并境条件中，并模模拟实际生生产完成工完成工艺操作。操作。对装有培养基的密装有培养基的密闭容器容器进行培养以行培养以检查微生物的生微生物的生长。评价价结果，果，应全部无菌。如有阳性全部无菌。如有阳性应调查实际生生产中（如灌装前的中（如灌装前的调试、加入无菌原、加入无菌原辅包材、无菌包材、无菌连接、灌装和密封）接、灌装和密封）产品品污染的来源。染的来源。培养基灌培养基灌封封验证通通过前前产品不能品不能释放。放。方法方法1：在灌装：在灌装线上直接灌装液体培养基，灌装后上直接灌装液体培养基，灌装后压塞塞-轧盖或熔封盖或熔封方法方法2：先灌装干粉培养基，再加入注射用水：先灌装干粉培养基，再加入注射用水方法方法3：先灌装惰性：先灌装惰性剂，再加入液体培养基，再加入液体培养基采用方法采用方法2/3时，所用惰性，所用惰性剂或干粉培养基需或干粉培养基需经辐射射灭菌。菌。常用惰性常用惰性剂有聚乙二醇有聚乙二醇8000、乳糖。、乳糖。培养基灌封（培养基灌封（Media Fill）试验）试验(1)50培养基灌封（培养基灌封（Media Fill）试验(2)首次首次验证，培养基灌封，培养基灌封应安排在一周内的不同安排在一周内的不同时间进行行，至少要至少要连续成功灌封成功灌封3个批次。个批次。再再验证，可，可选择在一周在一周结束或其它最差条件下束或其它最差条件下进行。至少需要成功灌行。至少需要成功灌封封1个批次个批次，一般再，一般再验证每年两次（每每年两次（每57个月）个月）。灌封灌封时间要涵盖要涵盖实际所有的所有的生生产班次。班次。设施施设备、生、生产线配置、重要人配置、重要人员、容器系、容器系统的的变更，更，环境境监控控结果果异常、停异常、停车时间延延长、无菌、无菌检查结果阳性等果阳性等变化化应考考虑再再验证。最差条件最差条件Worst case:灌封灌封设备、灌封部件、灌封部件、储罐、无菌物料需要再罐、无菌物料需要再灭菌的菌的时间间隔用超出保隔用超出保存存时间的灌封的灌封设备、灌封部件、灌封部件、储罐、无菌物料参与培养基灌封。罐、无菌物料参与培养基灌封。无菌无菌过滤后存放在后存放在储罐内的培养基到罐内的培养基到实际生生产时产品的最大品的最大储存存时间后后再灌封。再灌封。每位无菌生每位无菌生产包装人包装人员至少每年参与一次至少每年参与一次培养基灌封培养基灌封再再验证，但，但不都要不都要参与最差条件的模参与最差条件的模拟。并有文件。并有文件记录支持支持备查。模模拟正常的干正常的干扰（interventions）：灌封）：灌封线装配，称量装配，称量调节，取，取样，环境境监测。以及非正常的干。以及非正常的干扰：设备故障，灌封故障，灌封线堵塞，拆卸堵塞，拆卸/替替换。工工艺气体使用氮气的，因考气体使用氮气的，因考虑其不利于微生物生其不利于微生物生长，以，以压缩空气代替。空气代替。51培养基灌封（培养基灌封（Media Fill）试验(3)培养基的培养基的选择适适应广广谱微生物生微生物生长，较好的澄明度，好的澄明度，较小的粘度，可除菌小的粘度，可除菌过滤常用培养基：常用培养基：3大豆胰蛋白肉大豆胰蛋白肉汤（TSB）惰性惰性剂(Placebo)：聚乙二醇，乳糖和聚乙二醇，乳糖和/或肉或肉汤阳性阳性对照（培养基促生照（培养基促生长能力能力Promotion：灵敏度：灵敏度试验）取灌装前、中、后各取灌装前、中、后各阶段的培养基段的培养基样品品枯草芽枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌、杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌、铜绿假假单胞菌、黑胞菌、黑曲霉菌、曲霉菌、环境菌，每个菌种接种境菌，每个菌种接种2支，支，计数数100cfu/瓶瓶应在在20-25C/30-35 C 培养培养5天内生天内生长翻翻转接触所有表面后培养：接触所有表面后培养：20-25度度7天，天，30-35度度7天天 因因为培养基灌封培养基灌封样品数量巨大，一般日常品数量巨大，一般日常检验培养箱可能无法容培养箱可能无法容纳，通常使用一个能控温房通常使用一个能控温房间并并进行温度分布行温度分布验证通通过后使用。后使用。52包装容器密封性包装容器密封性验证目的：保目的：保证灭菌菌过程后和程后和产品有效期内密封系品有效期内密封系统的完整性的完整性密密闭系系统：安瓿或容器：安瓿或容器/胶塞系胶塞系统方法：方法：物理方法：物理方法：染料染料检漏法（漏法（辅以真空或以真空或压力），力），盐水渗入法水渗入法微生物微生物检测法：法：气溶胶法：将灌装培养基的气溶胶法：将灌装培养基的压盖容器放置在充盖容器放置在充满微生物的气溶微生物的气溶胶腔室内，保持一定温度、胶腔室内，保持一定温度、压力、湿度和力、湿度和时间微生物浸泡法：将灌装培养基的微生物浸泡法：将灌装培养基的压盖容器倒置在一定盖容器倒置在一定浓度的特度的特定微生物的溶液内，保持一段定微生物的溶液内，保持一段时间53微生物浸泡法操作步微生物浸泡法操作步骤菌液菌液待确认待确认密封口密封口支支架架培养基培养基容器容器选择试验菌种（大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、粘质选择试验菌种（大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌）沙雷氏菌）制备菌悬液制备菌悬液接种环置接种环置1010ml TSBml TSB中中30-3530-35度培养度培养16-1816-18小时，再置于小时，再置于1000 1000 ml TSBml TSB中培养中培养22-2422-24小时，浓度不小于小时，浓度不小于10106 6/mlml准备灌装有培养基的正常密封的西林瓶或软性包装准备灌装有培养基的正常密封的西林瓶或软性包装试验：试验：将铝盖去除将铝盖去除倒置于菌悬液中倒置于菌悬液中4 4小时小时取出后消毒外表面取出后消毒外表面培养培养7 7天，每天观察生长情况天，每天观察生长情况54公用系公用系统的的验证重点重点空空调系系统HVAC无菌气体（空气、氮气）系无菌气体（空气、氮气）系统药用用纯水系水系统(Purified Water)注射用水系注射用水系统(WFI-Water For Injection)清清洁蒸汽系蒸汽系统(Pure Steam)真空系真空系统55空空调系系统HVAC验证(1)HVAC洁净等等级分区分区图；人流、物流；人流、物流图风平衡、流向平衡、流向图；进、回、排、回、排风口布局口布局图环境境监控取控取样点分布点分布图（尘埃粒子、浮游菌、沉降菌）埃粒子、浮游菌、沉降菌）空空调机机组AHU的示意的示意图使用的使用的HEPA过滤器器级别（厂家（厂家过滤效率效率证明）明）HEPA过滤器完整性器完整性测试（PAO气溶胶气溶胶测试）尘埃粒子埃粒子监控、控、换气次数、气次数、压差流向、流速、温湿度差流向、流速、温湿度浮游菌、沉降菌浮游菌、沉降菌监控控结果。果。特殊特殊设计的局部的局部层流或流或单向流的向流的验证（发烟和烟和录像）像）排放除排放除尘系系统(Exhauster)结构和是否构和是否经过HEPA过滤排放。排放。对抗生素、激素、高活性抗生素、激素、高活性产品尤其品尤其严格。格。自自净时间56空空调系系统HVAC验证常用常用仪器器气溶胶发生器气溶胶发生器气溶胶光度计气溶胶光度计产生气溶胶烟雾产生气溶胶烟雾PAO（聚（聚-烯烃）烯烃）57无菌气体（空气、氮气）系无菌气体（空气、氮气）系统使用的使用的终端端过滤器器级别（厂家（厂家过滤效率效率证明）明）除菌除菌过滤器完整性器完整性测试（水侵入（水侵入试验）尘埃粒子埃粒子监控（无菌控（无菌A级标准）准）露点露点(含水量含水量)浮游菌浮游菌监控控无油（碳无油（碳氢化合物）化合物）管道材管道材质证明和明和预清洗清洗记录58药用用纯水系水系统和注射用水系和注射用水系统验证源水符合源水符合饮用水用水标准准化学化学项目目TOC电导率符合各国率符合各国药典典规定定注射用水的不溶性微粒符合注射用水的不溶性微粒符合药典要求典要求注射用水的注射用水的细菌内毒素符合菌内毒素符合药典要求典要求微生物指微生物指标，符合，符合药典典标准并周期性准并周期性监控控不管那种水都不管那种水都应该对用点用点轮换频繁（每周）取微生物繁（每周）取微生物样检验，并根据并根据统计制制订内控的警告限度内控的警告限度(Alert limit)和行和行动限度限度(Action limit)消毒消毒灭菌的方法和菌的方法和频次以及次以及验证管道、管道、储罐、罐、泵、换热器的材器的材质、抛光和、抛光和焊接接质量量管道斜率管道斜率设计、卫生隔膜生隔膜阀、无死角、无死角设计循循环管路的水流速管路的水流速线速度速度臭氧消毒的臭氧消毒的验证（消毒（消毒时浓度和使用前残留）度和使用前残留）酸洗酸洗钝化化SOP和清洗残留和清洗残留59清清洁蒸汽系蒸汽系统和真空系和真空系统验证清清洁蒸汽系蒸汽系统验证要点：要点：管道、管道、阀门适用性和材适用性和材质证明明冷凝水符合冷凝水符合药用用纯水水标准（化学、准（化学、电导率、率、TOC、内毒素）、内毒素）温度、温度、压力、力、产能和使用量配套能和使用量配套不可冷凝的气体不可冷凝的气体(No condensate gas)颗粒异物粒异物真空系真空系统验证要点：要点：负压保持和防止倒流保持和防止倒流安装除菌安装除菌过滤器并器并进行完整性行完整性测试60无菌无菌产品生品生产的的风险分析分析内源性的影响因素内源性的影响因素净化空化空调系系统设备（清洗、（清洗、灭菌菌难度，可能出度，可能出现黑点）黑点）工工艺过程程(灭菌、菌、过滤、干燥、分装、干燥、分装)物料和中物料和中间体的体的质量量外源性的影响因素外源性的影响因素人人员（培（培训、上、上岗认证）61示例示例1：原材料和内包装材料的：原材料和内包装材料的风险评估估潜在潜在风险微生物微生物质量缺陷量缺陷化学化学杂质后果后果可可导致致产品品灭菌前微生物含量失控菌前微生物含量失控可能引入有毒害的可能引入有毒害的杂质（不溶性异物）（不溶性异物）产生生风险的原因的原因供供应商商质量保量保证不完善（内包材、溶不完善（内包材、溶剂、辅料）料）注射用水系注射用水系统设计或管理不完善或管理不完善62示例示例1：原材料和内包装材料的：原材料和内包装材料的风险评估估管理措施管理措施采采购标准控制原准控制原辅包材料微生物限度包材料微生物限度供供应商均按商均按SOPSOP规定定经过严格格筛选每批每批检查微生物含量，微生物含量，严格管理格管理仓储条件条件内包装材料定点采内包装材料定点采购，热塑封装，防止淋湿和昆虫塑封装，防止淋湿和昆虫 污染染注射用水注射用水8080以上高速循以上高速循环按照按照SOPSOP对总回水口每日取回水口每日取样，对其它使用点其它使用点 每周循每周循环检验微生物和内毒素微生物和内毒素风险水平水平 年度年度质量回量回顾证明明质量量稳定，可以接受。定，可以接受。63示例示例2：灭菌前各工序菌前各工序风险评估估潜在潜在风险：灭菌前微生物失控菌前微生物失控 后果：后果：超出已超出已验证灭菌工菌工艺的范的范围，导致致灭菌不菌不彻底底 原因原因设备、包装容器清、包装容器清洁、消毒、消毒、灭菌不当菌不当生生产环境和操作人境和操作人员引入引入工工艺和关和关键设备偏差偏差残留微生物在适宜的条件下繁殖残留微生物在适宜的条件下繁殖64示例示例2：灭菌前各工序菌前各工序风险评估估管理措施（消除生管理措施（消除生产环境和人境和人员造成的造成的污染）染）符合欧盟符合欧盟动态标准的准的洁净区区A级下下连续微粒微粒监测，C级区每周区每周监测HVAC系系统由由计算机控制的恒算机控制的恒风量送量送风每年每年2次次DOP/PAO测试，证实HEPA完整性完整性无菌隔离器技无菌隔离器技术，最大程度消除人，最大程度消除人员污染染风险每年每年进行模行模拟生生产培养基灌装培养基灌装验证和和灭菌菌验证65示例示例2：灭菌前各工序菌前各工序风险评估估管理措施（工管理措施（工艺和关和关键设备偏差）偏差）控制各步控制各步骤的的时限限选用国用国际著名厂商的除菌著名厂商的除菌过滤器，使用前后完整性器，使用前后完整性测试，使用周期，使用周期经过验证。发生偏差后增生偏差后增补灭菌前微生物菌前微生物负荷量荷量样品品SOP明确明确规定了定了发生生诸如停如停电、通、通风系系统故障、故障、环境境卫生状况超生状况超标等偏差后等偏差后应采取的相采取的相应措施。措施。66示例示例2：灭菌前各工序菌前各工序风险评估估管理措施（管理措施（监控）控）制定制定灭菌前微生物含量警戒、菌前微生物含量警戒、纠偏、合格偏、合格标准准SOP保保证灭菌前微生物含量菌前微生物含量样品的代表性品的代表性样品品应反映最差情况反映最差情况风险水平水平 年度年度质量回量回顾可反映整体状况可反映整体状况