遗传病基因诊断学年课件

遗传病基因诊断学年遗传病基因诊断学年1主主要要内内容容一、基因诊断概念一、基因诊断概念二、基因诊断基本原理及常用技术二、基因诊断基本原理及常用技术1、核酸分子杂交、核酸分子杂交2、探针标记、探针标记3、PCR技术技术4、DNA测序测序5、DNA微阵列（微阵列（DNA芯片）芯片）三、基因诊断方法三、基因诊断方法四、基因诊断四、基因诊断-遗传病产前诊断遗传病产前诊断主 要 内 容一、基因诊断概念2一、基因诊断概念一、基因诊断概念传统诊断法传统诊断法:表现型表现型推测推测基因型。基因型。基因诊断法基因诊断法:基因型基因型推知推知表现型。表现型。检测核酸检测核酸分析分析特定基因特定基因判断判断基因型。基因型。基因诊断特征基因诊断特征:1.检测检测DNA不受被检测来源的限制。不受被检测来源的限制。2.症状前诊断成为可能。症状前诊断成为可能。3.对遗传病可进行分子水平再分类对遗传病可进行分子水平再分类-遗传异质性遗传异质性的分子水平阐明。的分子水平阐明。一、基因诊断概念传统诊断法:表现型 推测 基因型。3二、基因诊断基本原理及常用技术二、基因诊断基本原理及常用技术1、核酸分子杂交、核酸分子杂交双链双链DNA变性变性单链单链复性复性杂种杂种DNA加热加热,强酸强酸,探针探针强碱强碱,变性剂变性剂探针探针:一段与待测一段与待测DNA或或RNA互补的核苷酸序列互补的核苷酸序列,作为作为工作状态的探针必须是单链工作状态的探针必须是单链。常用探针种类常用探针种类:基因组基因组DNA,cDNA,人工合成的寡人工合成的寡核苷酸。核苷酸。二、基因诊断基本原理及常用技术1、核酸分子杂交4制备待测核酸样品制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化分离、变性、转移、固化DNA片段片段杂交杂交加入标记核酸探针加入标记核酸探针检测杂交信号检测杂交信号标记核酸探针标记核酸探针预杂交预杂交制备核酸探针制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针漂洗去除未参与杂交的标记探针核酸分子杂交操作程序核酸分子杂交操作程序制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段杂交加入标记5（1）斑点杂交）斑点杂交（Dotblottinghybridization）主要用于基因缺失和拷贝数改变。主要用于基因缺失和拷贝数改变。应用：应用：1）混合样品）混合样品DNA鉴定鉴定2）基因缺失检测）基因缺失检测3）基因表达分析）基因表达分析ASO探针（等位基因特异性寡核苷酸）探针（等位基因特异性寡核苷酸）-检测已知点突变。检测已知点突变。（1）斑点杂交（Dot blotting hybridiz6遗传病基因诊断学年课件7 磁激活细胞分选法(MACS)；PAH基因于1983年定位于12q24，全长85kb，含13个外显子，mRNA全长，编码451个氨基酸。（1）PCR-RFLP长度相同，但只要一个碱基的差别 形成不同构象 泳动速率不同 形成不同泳动带。其中最主要的是产前基因诊断：S CCTGTGG 应用FISH、PCR等技术分析特异基因。加热,强酸,探针产物2、FVIII基因intron 18中的Bcl I/RFLP；1 1 2 22、荧光原位杂交（FISH）方法；应用FISH、PCR等技术分析特异基因。4:检出 外显子19的先证者和胎儿；第1组为外显子19、43、45、34 引物富集和分离胎儿有核红细胞法:症状前诊断成为可能。探针:一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列,作为工作状态的探针必须是单链。四、基因诊断-遗传病产前诊断1975年年Southern建立的检测建立的检测DNA技术。技术。基因组基因组DNA限制酶消化限制酶消化凝胶电泳分离凝胶电泳分离变性变性转移到转移到硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜(尼龙膜尼龙膜)固定固定预杂交预杂交探针探针杂杂交交洗膜洗膜放射自显影放射自显影分析杂交片段的大分析杂交片段的大小及密度。小及密度。可检测可检测:DNA片段的缺失片段的缺失,插入插入,重排等。重排等。改变限制酶酶切位点的点突变。改变限制酶酶切位点的点突变。DNA扩增等拷贝数改变。扩增等拷贝数改变。RFLP等多态性。等多态性。（2）Southern印迹杂交印迹杂交 磁激活细胞分选法(MACS)；1975年Southern8遗传病基因诊断学年课件9遗传病基因诊断学年课件10检测检测RNA的分子杂交技术的分子杂交技术提取组织总提取组织总RNAoligodTmRNA含甲醛的含甲醛的琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离转移转移预杂交预杂交探针探针杂交杂交洗膜洗膜放射自显影。放射自显影。检测特异检测特异mRNA大小和表达量。大小和表达量。（3）Northern印迹杂交印迹杂交检测RNA的分子杂交技术（3）Northern 印迹杂交11遗传病基因诊断学年课件12遗传病基因诊断学年课件13染色体标本上，组织切片上分子杂交染色体标本上，组织切片上分子杂交原位杂交原位杂交-3H标记探针标记探针FISH-荧光素或生物素标记荧光素或生物素标记应用于基因定位，染色体数目及结构异常应用于基因定位，染色体数目及结构异常诊断。诊断。组织切片上的组织切片上的FISH-mRNA水平表达及一水平表达及一些病原体感染诊断。些病原体感染诊断。（4）原位杂交及荧光原位杂交）原位杂交及荧光原位杂交（Flurescenceinsituhybridization，FISH）染色体标本上，组织切片上分子杂交（4）原位杂交及荧光原位杂交14 肌球蛋白肌球蛋白mRNA在在胚胎小鼠心脏原位表达胚胎小鼠心脏原位表达肌球蛋白mRNA在胚胎小鼠心脏原位表达15荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）与染色体涂染）与染色体涂染荧光原位杂交（FISH）与染色体涂染16遗传病基因诊断学年课件171985年年cetus公司的公司的KaryMullis创建，创建，80年代一向革命性技术，年代一向革命性技术，1993年获诺贝尔年获诺贝尔化学奖。化学奖。模拟生物体内的模拟生物体内的DNA复制，在体外复制，在体外DNA聚聚合酶酶促合成某一特异合酶酶促合成某一特异DNA片断的技术。片断的技术。3、PCR技术技术（Polymerasechainreaction)1985年 cetus公司的Kary Mullis创建，818步骤：步骤：变性变性20-30周期周期复性复性延伸延伸引物的核苷酸顺序将决定扩增片段特异性及其长引物的核苷酸顺序将决定扩增片段特异性及其长度度。该技术灵敏度高，特异性强，操作简便，快捷，该技术灵敏度高，特异性强，操作简便，快捷，目前自动化操作。目前自动化操作。步骤：变性 19PCR扩增扩增PCR扩增20（1）PCR-RFLPPCR扩增后酶切，检测点突变或多态。扩增后酶切，检测点突变或多态。（1）PCR-RFLPPCR扩增后酶切，检测点突变或多21（2）PCR-SSCP单链构象多态（单链构象多态（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）：）：DNA单链在非变性胶单链在非变性胶中电泳时形成立体构象，其构象与碱基顺序相关。中电泳时形成立体构象，其构象与碱基顺序相关。长度相同，但只要一个碱基的差别长度相同，但只要一个碱基的差别形成不同构形成不同构象象泳动速率不同泳动速率不同形成不同泳动带。形成不同泳动带。能检测已知和未知点突变。能检测已知和未知点突变。（2）PCR-SSCP单链构象多态（single st22 -primer-32P-dNTP掺入掺入PCR扩增扩增产物产物变性变性单链单链DNA中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳12345自显影自显影 1.为正常为正常结果分析结果分析2、4、5纯合患者纯合患者3.为杂合子为杂合子 PCR-SSCP过程过程 -23遗传病基因诊断学年课件24(3)PCR-DGGE变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）Tm值值-DNA双链双链50%解链温度。解链温度。Tm值主要与碱基组成相关。值主要与碱基组成相关。PCR扩增后的扩增后的DNA，在变性梯度由低到高的聚丙，在变性梯度由低到高的聚丙烯酰氨凝胶电泳过程中，烯酰氨凝胶电泳过程中，Tm值低的值低的DNA片段先解片段先解链，电泳速度变慢链，电泳速度变慢一个碱基差异也能改变一个碱基差异也能改变Tm值导致泳动速率改变值导致泳动速率改变产生泳动变位，产生泳动变位，能检能检测已知，未知点突变。测已知，未知点突变。检测突变率比检测突变率比PCR-SSCP高。高。(3)PCR-DGGE变性梯度凝胶电泳（denatu25遗传病基因诊断学年课件26遗传病基因诊断学年课件274、DNA测序测序Sanger法法-双脱氧核苷酸末端终止法。双脱氧核苷酸末端终止法。双脱氧核苷酸不能形成双脱氧核苷酸不能形成5磷酸和磷酸和3OH之间的磷酸之间的磷酸二脂键（因二脂键（因3也脱氧）而终止反应。也脱氧）而终止反应。4个反应体系分别加入个反应体系分别加入ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP，将产生不同长度（在，将产生不同长度（在A，G，C，T处随处随机终止）的机终止）的DNA片段，分别在变性凝胶电泳分离片段，分别在变性凝胶电泳分离呈梯状带型，自下而上是呈梯状带型，自下而上是53被合成的被合成的DNA链链顺序。顺序。4、DNA测序Sanger法-双脱氧核苷酸末端终止法28遗传病基因诊断学年课件29遗传病基因诊断学年课件30DNA自动测序自动测序应用如上原理，不同的是：应用如上原理，不同的是：4种不同荧光染料标记的种不同荧光染料标记的dNTP掺入酶促反掺入酶促反应应(不用分不用分4个反应体系个反应体系)。经过毛细管凝胶电泳分离经过毛细管凝胶电泳分离(不用分不用分4个泳道个泳道)。激光分析和计算机处理，直接标出碱基序激光分析和计算机处理，直接标出碱基序列。列。DNA自动测序应用如上原理，不同的是：31遗传病基因诊断学年课件32遗传病基因诊断学年课件33焦磷酸测序焦磷酸测序焦磷酸测序34焦磷酸测序检测结肠癌焦磷酸测序检测结肠癌KRAS基因突变基因突变焦磷酸测序检测结肠癌KRAS基因突变35下一代下一代“克隆克隆”测测序序下一代“克隆”测序365、DNA微阵列（微阵列（DNA芯片）芯片）在杂交测序基础上发展起来的：在杂交测序基础上发展起来的：大规模集成电路手段把成千上万个寡核苷酸探针大规模集成电路手段把成千上万个寡核苷酸探针有规律地排列在指甲大小的芯片上有规律地排列在指甲大小的芯片上-制作寡核苷制作寡核苷酸阵列。酸阵列。将待测的将待测的DNA，RNA或或cDNA用荧光标记后在用荧光标记后在DNA芯片上与探针杂交。芯片上与探针杂交。用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，配合计算用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，配合计算机处理荧光信号，得出所需信息。机处理荧光信号，得出所需信息。5、DNA微阵列（DNA芯片）在杂交测序基础上发展起来的：37遗传病基因诊断学年课件38遗传病基因诊断学年课件39High-resolution melt curve analysis(HRM)High-resolution melt curve ana40Identification of copy number changes by array comparative genomic hybridization(CGH)Identification of copy number 41三、基因诊断方法三、基因诊断方法1、直接诊断：直接检测致病基因缺陷性质。、直接诊断：直接检测致病基因缺陷性质。能作直接诊断的条件：能作直接诊断的条件：遗传方式已知遗传方式已知病因基因或病因基因或cDNA已克隆分离已克隆分离突变性质与疾病关系已阐明突变性质与疾病关系已阐明基因突变类型：基因突变类型：1、DNA碱基置换碱基置换(点突变点突变)2、DNA片段的缺失、插入、重复等片段的缺失、插入、重复等3、动态突变、动态突变三、基因诊断方法1、直接诊断：直接检测致病基因缺陷性质。42检测点突变检测点突变已知点突变检测：已知点突变检测：1、RFLP2、ASO探针杂交法探针杂交法3、等位特异性、等位特异性PCR4、PCR-SSCP5、PCR-DGGE未知点突变检测：未知点突变检测：1、PCR-SSCP2、PCR-DGGE3、DNA测序测序4、DHPLC检测点突变已知点突变检测：未知点突变检测：43（1）RFLP方法方法-检测已知突变检测已知突变基因较大片段缺失或插入基因较大片段缺失或插入酶切片段长度改变。酶切片段长度改变。基因点突变正好发生在某限制酶识别位点基因点突变正好发生在某限制酶识别位点酶切酶切点消失或增加点消失或增加酶切片段长度改变。酶切片段长度改变。酶切图谱法检测的缺点酶切图谱法检测的缺点:不直接影响酶切点的突变不能检测到。不直接影响酶切点的突变不能检测到。产生的片段大小太相似也不易被检测到。产生的片段大小太相似也不易被检测到。特异性扩增含酶切位点的特异性扩增含酶切位点的PCR扩增片段，再经酶扩增片段，再经酶切后电泳检测切后电泳检测-更简便更简便,快速快速,也能弥补缺点也能弥补缺点。（1）RFLP方法-检测已知突变基因较大片段缺失或插入 44镰状细胞血红蛋白（镰状细胞血红蛋白（HbS）镰状细胞血红蛋白（HbS）4556bp54bp ACCTGAGG110bp SCCTGTGGMst II PCR 56 bp 46（2）ASO探针杂交法探针杂交法-检测已知点突变检测已知点突变等位特异性寡核苷酸探针（等位特异性寡核苷酸探针（allelespecificoligonucleotideprobe，ASO）以点突变为中心）以点突变为中心合成合成20bp左右的一对探针：左右的一对探针：与正常序列杂交的探针与正常序列杂交的探针与异常序列杂交的探针与异常序列杂交的探针优点：探针可准确合成；不改变酶切位点的突变优点：探针可准确合成；不改变酶切位点的突变也能检测。也能检测。缺点缺点:突变位点及性质清楚的前提下才能合成突变位点及性质清楚的前提下才能合成ASO探针，只能检测已知点突变。探针，只能检测已知点突变。（2）ASO探针杂交法-检测已知点突变等位特异性寡核苷酸探47遗传病基因诊断学年课件482、间接方法、间接方法-连锁分析法连锁分析法基因内或基因近旁基因内或基因近旁DNA多态为遗传标记进行连锁多态为遗传标记进行连锁分析，判断被检者是否得到带有致病基因的染色分析，判断被检者是否得到带有致病基因的染色体而作出诊断。体而作出诊断。DNA多态性（多态性（DNApolymorphism）：群体当中）：群体当中不同染色体上的基因每几百个不同染色体上的基因每几百个bp中大约有中大约有1个的个的比例存在碱基取代，但对表现型无改变，这种变比例存在碱基取代，但对表现型无改变，这种变异的频率在群体中占异的频率在群体中占1%以上，这种现象叫以上，这种现象叫DNA多多态性。态性。这种变异以孟德尔共显性遗传方式传递。这种变异以孟德尔共显性遗传方式传递。2、间接方法-连锁分析法基因内或基因近旁DNA多态为遗传49遗传病基因诊断学年课件50第一代遗传标记：限制性片段长度多态性第一代遗传标记：限制性片段长度多态性（Restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）第一代遗传标记：限制性片段长度多态性（Restriction51第二代遗传标记：数目可变的串联重复第二代遗传标记：数目可变的串联重复（Variablenumbertandemrepeat，VNTR）大约几十大约几十bp长的碱基序列在人群中其重复的拷贝长的碱基序列在人群中其重复的拷贝数不同所产生的多态，一般在非编码区中。数不同所产生的多态，一般在非编码区中。小卫星小卫星DNA(628bp)n微卫星微卫星DNA(26bp)n，也称，也称STRP（smalltandemrepeatpolymorphism）例如例如:FVIII基因基因ST14(DXS52)位点位点(60bp)nDMD基因基因intron44、45、49、50中中(CA)nPAH基因基因intron3中中STR(4bp)n优点优点:群体中等位基因数目多，杂合子频率高。群体中等位基因数目多，杂合子频率高。第二代遗传标记：数目可变的串联重复（Variable nu52遗传病基因诊断学年课件53遗传病基因诊断学年课件54遗传病基因诊断学年课件55遗传病基因诊断学年课件56第三代遗传标记：单核苷酸多态第三代遗传标记：单核苷酸多态（Singlenucleotidepolymorphism，SNP）基因组中广泛存在的碱基置换，大约几百基因组中广泛存在的碱基置换，大约几百1kb之中有一个。之中有一个。应用于：应用于：疾病的关联分析疾病的关联分析基因功能鉴定基因功能鉴定基因发现和制图基因发现和制图候选基因发现候选基因发现第三代遗传标记：单核苷酸多态（Single nucleot57连锁分析举例连锁分析举例连锁分析举例58连锁分析举例连锁分析举例连锁分析举例59连锁分析举例连锁分析举例连锁分析举例604.07.0II34.07.04.07.0I24.29.7II14.07.04.27.0I14.27.04.07.0II24.29.74.07.0连锁分析举例连锁分析举例4.0II 34.04.0I 24.2II 14.04.2I61连锁分析的优点连锁分析的优点不一定清楚病因基因的分子基础，只要有基因内不一定清楚病因基因的分子基础，只要有基因内或近旁或近旁DNA多态标记就可以分析。多态标记就可以分析。缺点缺点:1、必须要有先证者以及家系中相关各成员的、必须要有先证者以及家系中相关各成员的DNA才能分析。才能分析。2、携带者是杂合子时才能分析。、携带者是杂合子时才能分析。3、连锁分析要充分认识到由于减数分裂时同源、连锁分析要充分认识到由于减数分裂时同源染色体交叉互换导致误诊的可能性。染色体交叉互换导致误诊的可能性。连锁分析的优点不一定清楚病因基因的分子基础，只要有基因内或近62四、基因诊断四、基因诊断-遗传病产前诊断遗传病产前诊断1、甲型血友病（、甲型血友病（HemophiliaA）：）：FVIII因子遗传因子遗传性缺陷所致的凝血障碍性出血性疾病性缺陷所致的凝血障碍性出血性疾病.发病率：男性的发病率：男性的1/50001/10000，XR。症状症状:自然或轻微外伤后出血不止。自然或轻微外伤后出血不止。皮下、关节、肌肉出血皮下、关节、肌肉出血-关节强直、劳动力丧关节强直、劳动力丧失。失。颅内出血可危及生命。颅内出血可危及生命。根据血浆中根据血浆中F浓度可分为轻、中、重度。浓度可分为轻、中、重度。四、基因诊断-遗传病产前诊断1、甲型血友病（He63诊断、治疗诊断、治疗血浆代用品血浆代用品分离的分离的F因子因子基因工程产品基因工程产品FVIII因子因子基因治疗基因治疗FVIII基因于基因于1984年克隆并定位于年克隆并定位于Xq28，全长，全长186kb，含，含26个外显子，个外显子，25个内含子，个内含子，mRNA全全长为长为9kb，编码，编码2351个氨基酸。个氨基酸。由于致病基因突变类型复杂多样，且突变位点不由于致病基因突变类型复杂多样，且突变位点不集中集中-直接诊断受限制。直接诊断受限制。诊断、治疗血浆代用品 分离的F因子 基64间接基因诊断间接基因诊断方案：先检测方案：先检测SRY，ZFY/ZFX基因，诊断性别后基因，诊断性别后间接诊断间接诊断连锁分析连锁分析1、首先、首先ST14（DXS52）位点的）位点的VNTR多态；多态；2、FVIII基因基因intron18中的中的BclI/RFLP；3、FVIII基因基因intron22中的中的XbaI/RFLP；4、FVIII基因基因intron13中的（中的（CA）n多态。多态。直接诊断：检测直接诊断：检测i22的倒位。的倒位。间接基因诊断方案：先检测SRY，ZFY/ZFX基因，诊断性别65遗传病基因诊断学年课件66遗传病基因诊断学年课件67遗传病基因诊断学年课件68长度相同，但只要一个碱基的差别 形成不同构象 泳动速率不同 形成不同泳动带。4个反应体系分别加入ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP，将产生不同长度（在A，G，C，T处随机终止）的DNA片段，分别在变性凝胶电泳分离呈梯状带型，自下而上是5 3被合成的DNA链顺序。复性 延伸结果分析 2、4、5纯合患者 1.分离母体外周血中的胎儿细胞小卫星DNA(628bp)n 产生的片段大小太相似也不易被检测到。BMD比DMD发病晚，病情轻。不直接影响酶切点的突变不能检测到。FVIII基因 ST14(DXS52)位点(60bp)n基因点突变正好发生在某限制酶识别位点 酶切点消失或增加 酶切片段长度改变。PAH基因于1983年定位于12q24，全长85kb，含13个外显子，mRNA全长，编码451个氨基酸。富集和分离胎儿有核红细胞法:荧光原位杂交（FISH）与染色体涂染2、假肥大型肌营养不良症、假肥大型肌营养不良症(DMD/BMD)肌萎缩中占肌萎缩中占60%。由于抗肌萎缩蛋白（由于抗肌萎缩蛋白（dystrophin）遗传性缺陷所）遗传性缺陷所致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病。致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病。发病率为发病率为1/3500，XR遗传。遗传。BMD比比DMD发病晚，病情轻。发病晚，病情轻。主要症状：通常主要症状：通常3-5岁发病，开始走路不稳，鸭岁发病，开始走路不稳，鸭型步态，上楼梯困难，型步态，上楼梯困难，Gower征阳性，进行性肌征阳性，进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大，萎缩伴有腓肠肌假性肥大，10多岁下肢瘫，一般多岁下肢瘫，一般在在20多岁之前死于心衰或呼吸衰竭。多岁之前死于心衰或呼吸衰竭。长度相同，但只要一个碱基的差别 形成不同构象 69遗传病基因诊断学年课件70遗传病基因诊断学年课件71生化检测：血清中磷酸肌酸激酶（生化检测：血清中磷酸肌酸激酶（CPK）升高。）升高。肌电图：肌源性改变等。肌电图：肌源性改变等。1987年年Kunkel等克隆等克隆DMD基因，定位于基因，定位于Xp21，全长全长2400kb，含，含79个外显子，个外显子，cDNA长度为长度为14kb。目前已知目前已知DMD的的50%80%是由于是由于DMD基因不同基因不同区段的缺失，缺失发生热点区位于区段的缺失，缺失发生热点区位于DMD基因基因5端端（219）以及外显子）以及外显子4452。生化检测：血清中磷酸肌酸激酶（CPK）升高。72直接基因诊断：直接基因诊断：应用多重应用多重PCR（multiplexPCR）检测缺失，）检测缺失，12对引物（对引物（4 3），能检测），能检测98%缺失。缺失。多重链接依赖探针扩增（多重链接依赖探针扩增（Multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）间接诊断间接诊断:RFLP连锁分析连锁分析（CA）n连锁分析：连锁分析：DMD基因基因5端和端和3端，端，内含内含44、45、49、50中的（中的（CA）n多态，进行多态，进行单体型连锁分析。单体型连锁分析。直接基因诊断：73多重多重PCR检测缺失检测缺失Duchenne/Becker型肌营养不良型肌营养不良(DMD/BMD)方法：根据方法：根据DMD基因缺失的分布设计基因缺失的分布设计12对引物，对引物，分成分成3组：组：第第1组为外显子组为外显子19、43、45、34引物引物第第2组为外显子组为外显子51、12、50、53引物引物第第3组为外显子组为外显子48、17、8、52引物引物分别对患者基因组分别对患者基因组DNA进行扩增，每次扩增均同进行扩增，每次扩增均同时设空白和正常对照。时设空白和正常对照。多重PCR检测缺失Duchenne/Becker型肌营养不良741:DL2000marker；2:正常对照正常对照(第第1组引物组引物)；3.4:检出检出外外显子显子19的先证者和胎儿；的先证者和胎儿；5:正常对照正常对照(第第2组引物组引物)；6.7:检检出出外显子外显子51的先证者和胎儿；的先证者和胎儿；8:正常对照正常对照(第第3组引物组引物)；9.10:检出检出外显子外显子48的先证者和胎儿。的先证者和胎儿。1:DL2000marker；2:正常对照(第1组引物)；3753、苯丙酮尿症（、苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）由于苯丙氨酸羟化酶（由于苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninhydroxyrase，PAH）遗传性缺陷所致的遗传性）遗传性缺陷所致的遗传性氨基酸代谢病氨基酸代谢病发病率为发病率为1/16500，AR遗传。遗传。临床表现：临床表现：智力低下智力低下黑色素形成障碍黑色素形成障碍尿有特殊氨味尿有特殊氨味3、苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）由于76诊断、治疗诊断、治疗PAH基因于基因于1983年定位于年定位于12q24，全长，全长85kb，含，含13个外显子，个外显子，mRNA全长，编码全长，编码451个氨基酸。个氨基酸。PAH基因缺陷基因缺陷-以点突变为主，且以点突变为主，且1/3点突变集点突变集中于外显子中于外显子7，另外外显子，另外外显子6，11，12也较集中。也较集中。PKU基因诊断策略基因诊断策略:1、应用内含子、应用内含子3的的STR多态进行连锁分析。多态进行连锁分析。2、应用、应用PCRSSCP，PCRDGGE技术检测外显技术检测外显子第子第7、6、11、12的点突变。的点突变。诊断、治疗PAH基因于1983年定位于12q24，全长85k77遗传病基因诊断学年课件786%DGGE检测家系成员检测家系成员PAH基因外显子基因外显子6的电泳图的电泳图：1 1 2 2121N？6%DGGE检测家系成员PAH基因外显子6的电泳图：1 794、先天愚型（、先天愚型（Down综合征）综合征）最常见的常染色体病，发病率为最常见的常染色体病，发病率为1/7001/800，主要是主要是21三体所致（约三体所致（约5%是易位型和嵌合型）。是易位型和嵌合型）。临床特征：先天性智力低下、特殊面容、体格发临床特征：先天性智力低下、特殊面容、体格发育迟缓、伴先天畸型，特征性皮肤纹理等。育迟缓、伴先天畸型，特征性皮肤纹理等。基因诊断：基因诊断：1、应用、应用D21S11为遗传标记的定量为遗传标记的定量PCR；2、荧光原位杂交（、荧光原位杂交（FISH）方法；）方法；3、荧光定量、荧光定量PCR（QF-PCR）。）。4、先天愚型（Down综合征）最常见的常染色体病，发病率为180遗传病基因诊断学年课件81荧光定量荧光定量PCR方法检测方法检测21-三体三体荧光定量PCR方法检测21-三体82五、产前基因诊断进展五、产前基因诊断进展遗传病基因诊断主要应用遗传病基因诊断主要应用:1、产前基因诊断、产前基因诊断-终止妊娠；终止妊娠；2、携带者基因诊断、携带者基因诊断-指导婚姻、生育；指导婚姻、生育；3、症状前诊断、症状前诊断-如如HD，SCA等。等。其中最主要的是产前基因诊断：其中最主要的是产前基因诊断：孕孕7-8周绒毛周绒毛孕孕16-20周羊水周羊水无创性无创性-新进展新进展五、产前基因诊断进展遗传病基因诊断主要应用:83绒毛膜绒毛取样（绒毛膜绒毛取样（CVS）绒毛膜绒毛取样（CVS）84羊水穿刺羊水穿刺羊水穿刺85植入前诊断（植入前诊断（Preimplantationgeneticdiagnosis，PGD）受精卵卵裂受精卵卵裂68个细胞期显微操作获取：个细胞期显微操作获取：单个胚胎细胞单个胚胎细胞未受精极体未受精极体再应用再应用PCR、FISH等技术分析特异基因或染色体等技术分析特异基因或染色体畸变。畸变。正常正常-植入植入异常异常-遗传缺陷控制在最早阶段遗传缺陷控制在最早阶段已有报道：胎儿性别、囊性纤维化、甲型血友病、已有报道：胎儿性别、囊性纤维化、甲型血友病、HbS、染色体异常等的植入前诊断。、染色体异常等的植入前诊断。植入前诊断（Preimplantation genetic 86分离母体外周血中的胎儿细胞分离母体外周血中的胎儿细胞母体外周血中可用于产前诊断的细胞类型：合体母体外周血中可用于产前诊断的细胞类型：合体滋养细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿粒细胞、胎儿有滋养细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿粒细胞、胎儿有核红细胞（核红细胞（NRBC）。）。NRBC-有形态学特征：有形态学特征：胎儿有核红细胞单克隆抗体（如胎儿有核红细胞单克隆抗体（如CD71、CD36、GPA等）等）胎儿血红蛋白单克隆抗体（抗胎儿血红蛋白单克隆抗体（抗-和抗和抗-）分离母体外周血中的胎儿细胞母体外周血中可用于产前诊断的细胞类87富集和分离胎儿有核红细胞法富集和分离胎儿有核红细胞法:密度梯度离心法；密度梯度离心法；荧光激活细胞分选法荧光激活细胞分选法(FACS)；磁激活细胞分选法磁激活细胞分选法(MACS)；免疫磁珠法；免疫磁珠法；显微操作分选法。显微操作分选法。引物延伸预扩增引物延伸预扩增（primer-extensionpreamplication，PEP）扩增单个）扩增单个NRBCDNA。应用多个应用多个STR位点检测确定位点检测确定NRBC的胎儿源性。的胎儿源性。应用应用FISH、PCR等技术分析特异基因。等技术分析特异基因。富集和分离胎儿有核红细胞法:88分离孕妇血浆中的胎儿分离孕妇血浆中的胎儿DNA1997年年Lo等报道孕妇血浆或血清中存在胎儿游等报道孕妇血浆或血清中存在胎儿游离离DNA，可作为产前诊断材料。，可作为产前诊断材料。可能的机制为可能的机制为:1、胎儿细胞经胎盘进入母血，被母血免疫系统、胎儿细胞经胎盘进入母血，被母血免疫系统破坏，将破坏，将DNA留在血浆中。留在血浆中。2、胎盘在胎母界面不断塑形，细胞被溶解，将、胎盘在胎母界面不断塑形，细胞被溶解，将DNA释放入母体循环。释放入母体循环。分离孕妇血浆中的胎儿DNA1997年Lo 等报道孕妇血浆或血89遗传病基因诊断学年课件90遗传病基因诊断学年课件91