乙肝病毒DNA的实验室检测课件

乙肝病毒DNA的实验室检测乙肝病毒DNA的实验室检测1荧光定量PCR技术荧光定量PCR技术2荧光定量荧光定量PCR技术技术Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶（TaqDNA聚合酶）的作用，经过高温变性、低温退火、适温延伸高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内反复循环25-30次，把特定的DNA片段扩增1000万倍。每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的含有待扩增序列的DNADNA模板、模板、引物、引物、TaqDNATaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTPdNTP）荧光定量PCR技术Polymerase chain reac3 实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。荧光定量荧光定量PCR技术技术 实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标4PCR 反应过程5533d.NTPsTaq 酶Primers5353535353535353反应组分反应组分变变 性性535353535353PCR 反应过程5533d.NTPsTaq 酶Pri5延延 伸伸53535353353TaqTaq55重重 复复退退 火火延 伸5353535335365353535355335353循环循环24个拷贝个拷贝循环循环38个拷贝个拷贝535353535353535353535335535353535353535355335357荧光定量PCR原理插入染料法插入染料法 SYBR Green I杂交探针法杂交探针法(最常用最常用)TaqMan荧光定量PCR原理插入染料法8TaqMan探针5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反应体系变 性535353535353Taql53RQProbe53RQTaqMan探针5533d.NTPsTaq酶Prim9535353RQ退 火531.链取代Taq3QR5533QTaqR52.水 解3.聚 合53QTaqR354.检测荧光533QTaqR5l535353RQ退 火531.链取代T10乙肝病毒的感染乙肝病毒的感染11乙肝病毒的感染 （一）（一）乙型肝炎病毒结构及特点乙型肝炎病毒结构及特点HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAgHBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中一般不存在于血循环中HBcAb:非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBeAb：有一定的保护作用，预后良好乙肝病毒的感染 （一）乙型肝炎病毒结构及12乙肝病毒的感染（二）（二）HBV-DNAHBV-DNA与与“两对半两对半”1.“两对半”：机体的免疫反应状态；2.“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能不能 反反应应体内病毒复制水平与感染程度体内病毒复制水平与感染程度。FQ-PCRFQ-PCR：检测的是：检测的是HBVHBV本身的遗传物质本身的遗传物质DNADNA，是，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。HBsAg()HBV-DNA()HBeAg()HBV-DNA()3.血清学指血清学指标标()不能排除不能排除HBVHBV感染感染。乙肝病毒的感染（二）HBV-DNA与“两对半”1.“13乙肝病毒的感染阳性标本HBV DNA检出率90左右 HBeAgHBeAg与与HBV DNAHBV DNA有着良好的相关性有着良好的相关性4.也可能出现HBsAg()，HBV-DNA()。乙肝病毒的感染阳性标本HBV DNA检出率90左右4.也14乙肝病毒的感染HBV DNAHBV DNA贯穿感染者的终生，是评价病毒复制的金标准贯穿感染者的终生，是评价病毒复制的金标准ALT正常正常增高或者波动增高或者波动正常正常增高或者波动增高或者波动免疫耐受期免疫耐受期免疫清除期免疫清除期非活动或低非活动或低（非）复制期（非）复制期再活动期再活动期肝组织学肝组织学无明显异常无明显异常,或或轻度炎症纤维化轻度炎症纤维化中度或严重炎症、纤中度或严重炎症、纤维化快速进展维化快速进展无炎症或仅有轻无炎症或仅有轻度炎症度炎症中度或严重炎中度或严重炎症、肝纤维化症、肝纤维化临床诊断临床诊断慢性慢性HBV携带者携带者HBeAg阳性慢性乙型肝炎阳性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化乙型肝炎肝硬化非活动性非活动性HBsAg携带者携带者HBeAg阴性阴性慢性乙型肝炎慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化乙型肝炎肝硬化乙肝病毒的感染HBV DNAALT正常增高或者波动正常增高或15实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。血清学指标()不能排除HBV感染。HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标中度或严重炎症、肝纤维化非活动性HBsAg携带者每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。“两对半”：机体的免疫反应状态；HBV DNA检测的临床意义一般不存在于血循环中HBV DNA是患者具有传染性的标志血清学指标()不能排除HBV感染。实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）乙肝病毒的感染慢性慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标感染分期及相关实验室检测指标 鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展 实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧16HBV-DNA与临床HBV-DNA与临床17HBV DNA检测的临床意义HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV存在最直接的依据存在最直接的依据HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV复制的标志复制的标志HBV DNAHBV DNA是患者具有传染性的标志是患者具有传染性的标志HBV DNAHBV DNA对乙肝两对半起补充作用对乙肝两对半起补充作用HBV DNAHBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标HBV DNAHBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎可检测出隐匿性慢性乙型肝炎HBV DNA检测的临床意义HBV DNA是HBV存在最直接18（二）HBV-DNA与“两对半”Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。（二）HBV-DNA与“两对半”HBcAb:非保护性抗体，HBcAb-IgM血清学指标()不能排除HBV感染。每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）HBV DNA是患者具有传染性的标志HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标非活动性HBsAg携带者中度或严重炎症、肝纤维化实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。提示HBV处于复制状态HBV DNA是HBV存在最直接的依据HBV DNA检测的临床意义PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。PCRPCR检测“窗口期窗口期”核酸核酸检测缩短的短的“窗口期窗口期”的天的天数数HBVHBV56566-156-15HCVHCV707041-6041-60HIVHIV222210-1510-15有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断提供直接证据缩短提供直接证据缩短“窗口期窗口期”HBV DNA检测的临床意义（二）HBV-DNA与“两对半”PCR检测“窗口期”核19 调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。HBV DNA检测的临床意义 调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，20乙肝病毒DNA的实验室检测课件21乙肝病毒DNA的实验室检测课件22HBV DNA检测的临床意义HBsAgHBsAg和和HBeAgHBeAg均阳性而均阳性而HBV DNAHBV DNA阴性？阴性？干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。HBV DNA检测的临床意义HBsAg和HBeAg均阳性而H23谢谢观看！谢谢观看！24