骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中作用的研究课件

骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中作用的研究作者：#骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中作者：#目 录Contents一前言二材料和方法四结论三结果目 录Contents一前言二材料和方法四结论三结果一前言目 录Contents二材料与方法三结果四结论又称为Spp1(分泌型磷酸糖蛋白1)或ETA-1(早期T淋巴细胞活化因子)，是一种多功能的胞外基质蛋白，表达于多种组织和细胞中；有两种形式：分泌型骨桥蛋白(sOPN)和胞内型骨桥蛋白(iOPN)；早期研究发现，OPN能够抑制炎症反应的发生，但在不同的环境中OPN的作用可能会表现出不同的侧重。骨桥蛋白(OPN)研究背景累及全消化道的一种特发性肠道炎症性疾病；病因和发病机制尚未完全明确，已知肠道黏膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD发病中起重要作用；研究发现，OPN在炎症性肠病患者发炎的肠道组织中的表达增加。炎症性肠病（IBD）对患者会产生何种影响？问题一 前言目 录Contents二 材料与方法三 目 录Contents一前言二材料与方法三结果四结论研究目的（1）采用IBD小鼠模型实验观察OPN缺失对小鼠自发性结肠炎的影响（2）研究骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中的作用目 录Contents一 前言二 材料与方法三 目 录Contents二材料与方法一前言三结果四结论研究对象1野生型(WT)小鼠48只2白介素-10基因敲除(IL-10KO)小鼠74只3骨桥蛋白基因敲除(OPNKO)小鼠24只4骨桥蛋白/白介素-10双敲除(OPN/IL-10DKO)小鼠74只注选用3-12周的雌鼠。所有的小鼠在实验监控期间都经确诊不携带仙台病毒，肝炎病毒，先天性脚趾不全畸形病毒，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，霉浆菌，毛发样梭状芽孢杆茵，库氏棒杆菌和沙门氏菌。目 录Contents二 材料与方法一 前言三 临床症状临床评分标准目 录Contents体重下降超过5%脱肛腹泻二材料与方法一前言三结果四结论对IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠的临床症状表现进行评分。出现该临床症状计1分，否则为0。合计得出总分。肛周粘液分泌物临床症状临床评分标准目 录Contents体重下降超过5%脱目 录Contents二材料与方法一前言三结果四结论实验方法与步骤患结肠炎小鼠患结肠炎小鼠结肠结肠组织组织切片微观分析切片微观分析基因表达定量分析基因表达定量分析荧光原位杂交技术（荧光原位杂交技术（FISHFISH）检测分泌的磷蛋白检测分泌的磷蛋白1 1基因编码基因编码区区OPNOPN酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法量化上清液中量化上清液中TNF-TNF-、IL-6IL-6、IL-12p40IL-12p40含量含量小鼠肠粘膜固有层单个小鼠肠粘膜固有层单个核细胞的分离核细胞的分离末端限制性片段长度多态性末端限制性片段长度多态性分析分析提取小鼠腹腔巨噬细提取小鼠腹腔巨噬细胞胞分析分析吞噬作用吞噬作用肠系膜淋巴结细菌种类的肠系膜淋巴结细菌种类的鉴别鉴别统计分析统计分析(非参数非参数Mann-Whitney U Mann-Whitney U 检验或检验或BonferroniBonferroni校正单向分析校正单向分析)87654321910小鼠骨髓衍生的巨噬细胞的小鼠骨髓衍生的巨噬细胞的准备和刺激准备和刺激目 录Contents二 材料与方法一 前言三 目 录Contents二材料与方法一前言三结果四结论实验方法与步骤1.提取mRNA（异硫氰酸胍-酚氯仿法）；2.进行反转录（SuperScriptII反转录酶）；3.分析互补DNA对GAPDH，IL-6，IFN-，IL-17A和CD11bmRNA的表达（LightCycler480SystemII）；4.目的基因以GAPDH为参照标准。基因表达定量分析GAPDH5-CAACTTTGTCAAGCTCATTTCC-3(正)5-GGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3(反)IL-65-AGTCCGGAGAGGAGACTTCA-3(正)5-ATTTCCACGATTTCCCAGAG-3(反)IFN-5-AGCTCTTCCTCATGGCTGTT-3(正)5-ATCTGGCTCTGCAGGATTTT-3(反)IL-17A5-TCTCTGATGCTGTTGCTGCT-3(正)5-CGTGGAACGGTTGAGGTAGT-3(反)CD11b5-GCTCCGGTAGCATCAACAAC-3(正)5-AGTGAATCCGGAACTCGTCCG-3(反)引物序列目 录Contents二 材料与方法一 前言三 目 录Contents二材料与方法一前言三结果四结论实验方法与步骤1.小鼠股骨和胫骨骨髓中提取骨髓细胞；2.含10%热灭活的胎牛血清，100mg/ml链霉素，100mg/ml青霉素和40ng/ml重组巨噬细胞集落刺激因子RPMI1640培养液中37C培养5天；3.衍生的巨噬细胞按5105个细胞/孔接种于6孔培养板，经10ng/mlIFN-隔夜孵化后，用以下刺激物（Pam3CSK450-500ng/ml、LPS100ng/ml、ODN1585500nM）刺激细胞24h；4.吸取上清液-80冷冻保存备用。小鼠骨髓巨噬细胞的准备和刺激目 录Contents二 材料与方法一 前言三 目 录Contents二材料与方法一前言三结果四结论实验方法与步骤1.小鼠结肠组织切片，PBS冲洗；2.含5mMEDTA和1mM二硫苏糖醇汉克平衡盐缓冲液中去除上皮细胞；3.含0.5mg/ml胶原酶D、0.5mg/mlDNA酶I、3mg/mlDispaseIIPBS中用37摇床孵育30分钟慢速旋转，弃上清用40%的Percoll分离液重悬，80%Percoll分离液覆盖；4.离心后即可在两层Percoll液的界面上获取LPMCs，PBS洗涤5.LPMCs中提取RNA小鼠肠粘膜固有层单个核细胞的分离目 录Contents二 材料与方法一 前言三 目 录Contents二材料与方法一前言三结果四结论实验方法与步骤1.小鼠盲肠置于含100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH9.0)、40mM乙二胺四乙酸、4M硫氰酸胍0.001%溴麝香草酚蓝的溶液中，分解悬浮物中的粪便，提取粪便DNA；2.5-FAM-labeled516f和1510r作引物从粪便DNA中生成16srRNA扩增子，10UofBsll处理3小时，ABIPRISM3130 xl基因分析仪进行分馏；3.OTUs分析13bp长度末端限制性片段，得到T-RFLP文件，进行主成分分析。末端限制性片段长度多态性分析目 录Contents二 材料与方法一 前言三 目 录Contents二材料与方法一前言三结果四结论实验方法与步骤1.小鼠腹腔注射3mL4%巯乙酸，第4天获取腹膜渗出细胞。去除红细胞，使用抗CD11b磁珠选择CD11b阳性thioglycollate诱导的腹膜巨噬细胞(TEPMs)；2.TEPMs按2.5105个细胞/孔接种于96孔培养板，经含40ng/ml重组巨噬细胞集落刺激因子的RPMI1640中隔夜孵化，PBS清洗，在这些孔中，分别增加重组OPN浓度1,10,100,1000ng/ml，细胞在37C培养；3.在活细胞成像溶液中用荧光粒子稀释,用荧光酶标仪在指定时间测量荧光强度。4.所有实验孔中，通过减弱阴性对照孔平均荧光强度评估吞噬活性小鼠腹腔巨噬细胞的提取和吞噬作用分析目 录Contents二 材料与方法一 前言三 目 录Contents二材料与方法一前言三结果四结论实验方法与步骤1.在无菌条件下获得MLNs，提取细菌DNA；2.通用引物(27F；5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,1492R；5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)扩增细菌的16srRNA，内引物(35F；5-CCTGGCTCAGGATGAACG-3；519R；5-ATTACCGCGGCKGCTC-3)扩增巢式PCR；3.1%琼脂糖凝胶电泳扩增产物，用QIAEXII凝胶萃取设备提纯，绑定到PCR4-TOPO载体，使用TOPO-TA克隆工具将其转变为E.coliTOP10细胞;4.TempliPhi系统扩增16SrRNA基因，用作DNA测序模板。ABI3730DNA分析仪进行分析，从日本DNA数据库中对应所有条目，BLAST分析检查所有的核苷酸序列，用DNA序列分析软件进行匹配。肠系膜淋巴结细菌种类(MLNs)的鉴别目 录Contents二 材料与方法一 前言三 目 录Contents三结果二材料与方法一前言四结论OPNKO小鼠没有出现自发性结肠炎OPNKO小鼠直肠组织HE-染色剂图像WT小鼠和IL-10KO小鼠直肠组织OPN基因的表达IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠临床得分随时间的变化情况OPN缺失导致IL-10KO小鼠结肠中合成OPNmRNA增多OPN/IL-10DKO小鼠表现出结肠炎症状目 录Contents三 结果二 材料与方法一 14目 录Contents三结果二材料与方法一前言四结论IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠组织学得分变化情况（左）和4周龄直肠组织HE-染色剂图像（右）4周龄IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠结肠组织IL-6、IFN-和IL-17A基因表达OPN/IL-10DKO小鼠很快发生结肠炎，而在4周龄发生免疫细胞浸润增多和显著的直肠上皮增生OPN/IL-10DKO小鼠结肠组织中促炎性细胞因子的基因表达比IL-10KO小鼠多目 录Contents三 结果二 材料与方法一 15目 录Contents三结果二材料与方法一前言四结论4周龄的WT、IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠直肠组织OPNmRNAFISH图像IL-10KO小鼠直肠组织合成OPNmRNA更多4周龄IL-10KO小鼠直肠组织OPNmRNAFISH图像(红)E-cadherin免疫荧光染色(绿)IL-10KO小鼠结肠上皮细胞OPN的合成增多目 录Contents三 结果二 材料与方法一 16目 录Contents三结果二材料与方法一前言四结论3周龄IL-10KO小鼠和OPN/IL-10DKO小鼠粪便样本T-RFLP数据主要成分分析T-RFLP数据IL-10KO小鼠和OPN/IL-10DKO小鼠肠道细菌组成有明显差异OPN/IL-10DKO小鼠有更低丰度的梭状芽孢杆菌亚群XIVa和更高丰度的梭状芽孢杆菌XVIII目 录Contents三 结果二 材料与方法一 目 录Contents三结果二材料与方法一前言四结论IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠结肠组织CD11b基因表达刺激物刺激WT、OPNKO、IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠产生BMDMs细胞因子数量IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠LPMCs中NOS2,TNF-,andIL-12p40基因的表达OPN能影响巨噬细胞的活动目 录Contents三 结果二 材料与方法一 18目 录Contents三结果二材料与方法一前言四结论WT、OPNKO、IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠在E.Coli荧光共轭粒子作用后TEPMs荧光强度的变化情况OPNKO小鼠在E.Coli荧光共轭粒子作用TEPMs荧光强度的变化情况OPN能影响巨噬细胞的吞噬功能目 录Contents三 结果二 材料与方法一 19目 录Contents三结果二材料与方法一前言四结论3周龄IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠肠系膜淋巴结细菌种类相比IL-10KO小鼠，OPN/IL-10DKO小鼠肠系膜淋巴结细菌种类更多目 录Contents三 结果二 材料与方法一 20目 录Contents结论四结论三结果二材料与方法一前言OPN缺失会加快IBD小鼠自发性结肠炎的发病。OPN的合成集中在结肠上皮细胞，并对炎症信号迅速响应。OPN缺失会影响体内肠道菌群，sOPN和iOPN都能够控制巨噬细胞吞噬功能。自发性结肠炎时OPN对肠道细菌的具体作用和对体内巨噬细胞吞噬功能的影响有待进一步研究，它会对OPN在结肠炎各阶段作用和IBD的病理生理学研究提供新的认识。目 录Contents结论四 结论三 结谢谢！作者：#谢谢！作者：#