免疫检测常用方法及运用秦伟

免疫检测常用方法及应用免疫检测常用方法及应用肥城市人民医院检验科肥城市人民医院检验科秦秦 伟伟l免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、补体、细胞因子等免疫相关物质及微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素、毒品等试验方法。l这些方法所具有的特异性好、敏感性高、简单、快速和稳定的特点为临床上确定诊断、分析病情、调整治疗方案和判断预后等提供有效的实验依据，使它们在临床的应用进一步普及和推广。凝集反应(agglutination)l颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应的抗体，或可溶性抗原(亦可用抗体)吸附于与免疫无关的载体形成致敏颗粒与相应的抗体(或抗原)，在有适量电解质存在下，形成肉眼可见的凝集小块。凝集反应的分类l直接凝集反应l间接凝集反应l抗人球蛋白试验（Coombs试验）直接凝集反应l颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应的抗体在有适量电解质存在下，形成肉眼可见的凝集小块。l常见的应用是血型的鉴定血型鉴定示意图间接凝集反应l将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集的现象称间接凝集反应（indirectagglutination）或被动凝集反应（assiveagglutination）。间接凝集反应l常用的载体微球有人O型血红细胞、绵羊或家兔红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭/甲苯胺红、明胶颗粒等间接凝集反应l正向间接凝集反应l反向间接凝集反应正向间接凝集反应l用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体正向间接凝集反应 胶乳凝集试验l所用载体颗粒为羧化的聚苯乙烯胶乳，是一种直径约为0.8m大小的圆形颗粒，带有负电荷，可物理性吸附蛋白分子。l将溶血素O 吸附在羧化的聚苯乙烯胶乳颗粒上检测抗”O”。l将变性IgG包被于羧化的聚苯乙烯胶乳颗粒上检测RF。正向间接凝集反应 RPR/TRUST试验l血浆反应素试验(RPR)所用载体颗粒为活性炭颗粒l甲苯胺红不加热血清反应素试验 （TRUST）所用载体颗粒为甲苯胺红颗粒正向间接凝集反应 RPR试验正向间接凝集反应 TRUST试验正向间接凝集反应 明胶颗粒凝集试验l所用载体为人工合成的惰性明胶颗粒l梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）l肺炎支原体抗体检测（MP-Ab）正向间接凝集反应 TPPA试验正向间接凝集反应 TPPA试验正向间接凝集反应 MP-Ab试验正向间接凝集反应 MP-Ab试验正向间接凝集反应 MP-Ab试验正向间接凝集反应 MP-Ab试验l检测肺炎支原体的总抗体（IgM,IgA IgG)l以滴度的方式报告检测结果（1:80 1:80、1：160、1:320)反向间接凝集反应l用已知特异性抗体致敏载体以检测用已知特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。标本中的相应抗原。抗人球蛋白试验（Coombs试验）l抗人球蛋白抗体参与的间接血凝试验，用于检测抗红细胞不完全抗体l分类：直接Coombs试验 间接Coombs试验 直接Coombs试验间接Coombs试验凝集反应总结一、直接凝集反应 血型鉴定二、间接凝集反应 胶乳凝集试验 ASO/RF1正向间接凝集反应 RPP/TRUST 明胶颗粒凝集 TPPA/MP2反向间接凝集反应三、抗人球蛋白试验 直接/间接Coombs试验 酶联免疫吸附试验（ELISA）l 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。l 使抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。l 标本中的抗原或抗体、酶标抗原或抗体按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应，并通过底物与酶的反应来反映标本中的抗原或抗体的量。酶联免疫吸附剂试验酶联免疫吸附试验l双抗体夹心法l双抗原夹心法l间接法l竞争法 l捕获法测 IgM 抗体ELISA双抗体夹心法l用特异性抗体进行包被和制备酶标抗体，以检测相应的抗原。l乙肝标志物中HBsAg、HBeAg的检测常采用本法ELISA双抗体夹心法ELISA双抗体夹心法ELISA双抗原夹心法l用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。l抗HBs的检测l抗HCV的检测l抗HIV的检测ELISA双抗原夹心法 ELISA竞争法 l标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。如受检标本中无抗体，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。加入酶标抗原后就显色深。如受检标本中含有抗体，则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了酶标抗体与固相抗原结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。加入酶标抗原后就显色浅或不显色。ELISA竞争法 ELISA竞争法 l最常见的应用：l乙肝HBeAb、HBcAb检测ELISA捕获法l（1）将抗人 IgM 抗体（抗人 IgM 链抗体）连接在固相载体上，形成固相抗人 IgM。l（2）加入标本，IgM 抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他抗体。l（3）加入特异性抗原试剂，它只与固相上的特异性 IgM 结合，洗涤。l（4）加入针对特异性抗原的酶标抗体，形成固相二抗 IgM抗体抗原 酶标抗体复合物。l（5）加底物显色，如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性 IgM 抗体存在，是为阳性反应。ELISA捕获法l以优生四项IgM抗体检测为例ELISA捕获法l甲肝IgM抗体测定ELISA总结l酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。它的最小可测值达 ng 甚至 pg 水平。酶免疫测定标记试剂比较稳定，且无放射性危害。因此，酶免疫测定的应用日新月异，酶免疫测定的新方法、新技术不断发展。固相膜免疫测定l利用微孔膜（主要是醋酸纤维素膜）作为固相进行免疫检测的方法l根据标记物的不同分为两类：l 酶标固相膜免疫测定：酶免疫斑点法 酶免疫印迹法 l 金标法：胶体金斑点渗滤试验 胶体金免疫层析试验酶标固相膜免疫测定原理酶免疫斑点法l常应用于自身抗体的检测酶免疫印迹法 胶体金斑点渗滤试验胶体金斑点渗滤试验胶体金免疫层析试验l金标双抗体夹心法测抗原l将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。若标本中有待测特异抗原，其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条（T）。过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。胶体金免疫层析试验胶体金免疫层析试验l检测HIVAb的双抗原夹心法金标法的应用lHCG的检测金标法的应用lHBs-Ag的检测金标法的应用l大便潜血试验（FOB）金标法的应用l轮状病毒和腺病毒抗原检测金标法的应用l幽门螺杆菌（HP）抗原检测金标法的应用lO1群霍乱弧菌检测金标法的应用lHCV-Ab检测金标法的应用l艾滋病抗体金标检测金标法总结l上述两种试验的共同特点是：简便、快速、单份测定、可立等结果，除试剂外无需任何仪器设备，且试剂稳定。因此特别适用于急诊检验。l但这类试验不能准确定量，所以主要限于检测正常体液中不存在的物质（例如诊断传染病中的抗原或抗体）以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如 HCG 等）。l虽然检测敏感性和特异性还不如ELISA高，但是检测的项目越来越多和上述的特点使其应用越来越广泛。