离子交换层析

第九章第九章 离子交换层析及凝胶离子交换层析及凝胶过滤介质过滤介质 一、基本原理一、基本原理 离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的，基质与电荷基因以共价键连 接，电荷基因与反离子以离子键结合。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA+B+RB+A+离子交换层析 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。此法广泛应用于很多生化物质(例如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等)的分析、制备、纯化，以及溶液的中和、脱色等方面。离子交换色谱中所进行的离子交换过程（以阳离子交换树脂为例）离子交换色谱中所进行的离子交换过程（以阳离子交换树脂为例）离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。强酸性(阳性)离子交换剂对H+的结合力比对Na+的小；强碱性(阴性)离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的小得多；弱酸性离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大；弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大。因此，在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一。离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水化作用形成的)的结合力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。所以，离子价数越高，结合力越大。在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大。两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于等电点(pI)时，它们带正电荷能与阳离子交换剂结合；反之，pH高于pI时，它们带负电荷能与阴离子交换剂结合。pH与pI的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开，其主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。氨基酸的离子交换分离原理氨基酸的离子交换分离原理What happens in ion exchange?Equilibration+-anion exchange bead8What happens in ion exchange?Sample applicationand wash-+-9What happens in ion exchange?Elution-+-10What happens in ion exchange?Regeneration-+11What happens in ion exchange?Sampleapplicationand washElutionEquilibrationRegeneration-+-121 1上样阶段上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合，此时离子交换剂与平衡离子结合；（平衡；（平衡 阶段）阶段）2 2吸附阶段吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合；，混合样品中的分子与离子交换剂结合；3 3开始解吸阶段开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱 而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；4 4完全解吸阶段完全解吸阶段，目标分子被洗脱；，目标分子被洗脱；5 5再生阶段再生阶段，用起始缓冲液重新平衡层析柱，用起始缓冲液重新平衡层析柱，以备下次以备下次 使用。使用。离子交换层析一般步骤离子交换层析一般步骤氨基酸的分离过程氨基酸的分离过程二、离子交换剂的部分性质二、离子交换剂的部分性质 粒度粒度基质颗粒大小直接关系到分离效果，颗粒越小，层基质颗粒大小直接关系到分离效果，颗粒越小，层析柱的理论塔板数就越大，分离效果越好，但同时析柱的理论塔板数就越大，分离效果越好，但同时交换容量变小，层析时背景压力增大，限制了流速交换容量变小，层析时背景压力增大，限制了流速的提高，因此细颗粒的介质常适用于分析型分离；的提高，因此细颗粒的介质常适用于分析型分离；相反，基质颗粒越大，柱效率会下降，但离子交换相反，基质颗粒越大，柱效率会下降，但离子交换剂的交换容量提高，背景压力减小，因此大颗粒介剂的交换容量提高，背景压力减小，因此大颗粒介质适合于实验室小规模分离及大规模工业化分离。质适合于实验室小规模分离及大规模工业化分离。交联度和网孔结构交联度和网孔结构交联度的大小影响着离子交换剂的很多特交联度的大小影响着离子交换剂的很多特性，包括机械强度、膨胀度、网孔大小、性，包括机械强度、膨胀度、网孔大小、交换容量等。交换容量等。一般交联度越高，网孔的孔径越小；交联一般交联度越高，网孔的孔径越小；交联度越低，网孔孔径越大。仅琼脂糖交换度越低，网孔孔径越大。仅琼脂糖交换剂是例外剂是例外.交联度和网孔结构交联度和网孔结构分离介质的孔有分离介质的孔有3种结构。第一种通过交联使种结构。第一种通过交联使大分子链间形成孔，这叫凝胶孔。大分子链间形成孔，这叫凝胶孔。第二种在有溶剂存在条件下进行聚合，称为大第二种在有溶剂存在条件下进行聚合，称为大孔树脂。孔树脂。第三种为琼脂糖介质的孔，孔径大小仅与琼脂第三种为琼脂糖介质的孔，孔径大小仅与琼脂糖浓度有关，交联对孔结构影响不大。糖浓度有关，交联对孔结构影响不大。电荷密度电荷密度电荷密度是指基质颗粒上单位表面积的取代电荷密度是指基质颗粒上单位表面积的取代基（功能集团）的数量，它决定着离子交基（功能集团）的数量，它决定着离子交换剂的交换容量、膨胀度等性质。对小分换剂的交换容量、膨胀度等性质。对小分子进行离子交换时，交换剂上功能基团密子进行离子交换时，交换剂上功能基团密度越大，工作能力越强，高电荷密度的离度越大，工作能力越强，高电荷密度的离子交换剂具有优势。子交换剂具有优势。膨胀度膨胀度又称吸水值，是指当干态的离子交换剂在又称吸水值，是指当干态的离子交换剂在水溶液中吸水后造成体积膨胀的程度，通水溶液中吸水后造成体积膨胀的程度，通常用每克干胶吸水膨胀后的体积（毫升）常用每克干胶吸水膨胀后的体积（毫升）来表示。来表示。交换容量交换容量交换容量是指离子交换剂能够结合溶液中可交换离交换容量是指离子交换剂能够结合溶液中可交换离子的能力，通常分为总交换容量和有效交换容量。子的能力，通常分为总交换容量和有效交换容量。总交换容量总交换容量用每克干介质或每毫升湿胶包含的带电用每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量来表示功能基团的数量来表示.可以通过酸碱滴定的方法可以通过酸碱滴定的方法来测定，也可使得离子交换剂和某种小的离子之来测定，也可使得离子交换剂和某种小的离子之间发生完全交换，然后通过测定该离子的含量算间发生完全交换，然后通过测定该离子的含量算出总交换容量，总交换容量并不反映交换剂对可出总交换容量，总交换容量并不反映交换剂对可交换分子的结合情况交换分子的结合情况.有效交换容量有效交换容量指每克干介质或每毫升湿胶在一定指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某种分子的实际容量。由于的实验条件下吸附某种分子的实际容量。由于有效容量是一个变值，在说明其数值时应当同有效容量是一个变值，在说明其数值时应当同时指出实验条件时指出实验条件.一般情况下，同一种交换剂对于分子量小的蛋白一般情况下，同一种交换剂对于分子量小的蛋白质有效交换容量较大，而对于分子量大的蛋白质有效交换容量较大，而对于分子量大的蛋白质有效容量较小；对于同一种蛋白质，离子交质有效容量较小；对于同一种蛋白质，离子交换剂的交联度越小有效容量越大，而交联度越换剂的交联度越小有效容量越大，而交联度越大有效容量越小。大有效容量越小。二、离子交换剂二、离子交换剂 离子交换剂应满足的基本条件有：有高度的不溶性。即在各种溶剂中不发生溶解；有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换；有较多的交换基团；有稳定的物理化学性质。在使用过程中，不因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。(一一)离子交换剂的种类离子交换剂的种类 根据离子交换剂中基质的组成和性质，可将其分成两大类：1.1.疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂 疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合力较小的树脂。常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱三种电荷基团)和螯合离子交换树脂(对金属离子有较强的选择性)。(1)(1)阳离子交换剂阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电。因此，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型(带磺酸基团)、中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型(带羧基的或酚基)三种。(2)(2)阴离子交换剂阴离子交换剂 阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺-N(CH3)3、叔胺-N(CH3)2、仲胺-NHCH3和伯胺-NH2基团构成的。当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂。当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。树脂型离子交换剂一般都呈网络结构的珠状体，其大小在20-50目之间。近年Bio-Rad公司还制造了50-100目、100-200目以及200-400目的产品，目数大的树脂对提高分辨率和交换容量是有利的。疏水性的离子交换剂由于含有大量的活性基团，交换容量高、机械强度大、流动速度快。因此，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物质，其次可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)、清洁剂(如tritonX-100)、尿素、两性电解质(Ampholyte)。此外，还可用于分离某些不易变性的蛋白质。疏水性的离子交换剂对带电荷多和疏水性强的被分离物有较强的截留能力。阳离子交换树脂对氨基酸的分离 2.2.亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂 这类交换剂与水的亲和力较大，载体孔径大，适合于分离生物大分子，有多种类型：(1)纤维素离子交换型 以纤维素为基质，常用的功能基因有磷酸基(P.中强酸型)、磺酸乙基(SE，强酸型)、羧甲基(CM、弱酸型)、三乙基氨基乙基(TEAE，强碱型)、二乙氨基乙基(DEAE，弱碱型)、氨基乙基(AE，中等碱型)、三乙醇基氨基(ECTE，中等碱型)等，可制成纤维状、微粒、短纤维、球形四种类型，Pharmacia(GE)公司生产的DEAE-Sephacel为球形颗粒，机械性能和理化稳定性好，对蛋白质、核酸、激素等均有良好的分辨率、回收率和交换容量，使用简单方便，在生物化学与分子生物学中使用普遍。此外，Watman公司的DE-、CM-、P-、AE-、SE-及QA-纤维素，Bio-Rad公司的CellexD、CellexE、CellexP和CellexCM，及一些国产的DEAE-纤维素和CM-纤维素也可选择使用。(2)葡聚糖系离子交换剂 以SephadexG25和G50为基质，分别引入DEAE、QAE(二乙基(二羧 丙基)氨基乙基，弱碱型)、CM、SP(磺丙基、强酸型)等功能基因，构成8种交换剂，交换容量较离子交换纤维素大，除离子交换作用外，还有分子筛作用，但层析时床体积随洗脱剂离子强度的增加而缩小，以SephadexG50为基质的交换剂尤其明显，为使用带来不便。(3)琼脂糖系列离子交换剂：琼脂糖系列离子交换剂：以琼脂糖为基质，主要有Pharmacia(GE)公司的Sepharose和Bio-Rad公司的Bio-gel两个系列。Sepharose系列离子交换剂：早期产品为DEAE-Sepharose CL-6B和CM-Sepharose CL-6B，对生物大分子分辨力好，交换容量大，床体积随洗脱液的离子强度和pH的改变小，使用较 Sephadex系列方便。后续产品Sepharose Fast Flow(Sepharose FF)理化稳定性和机械性能更好。交换容量大，可以在床清洗，床体积随pH的离子强度变化很小，由于流速和载量高，适合于进行大量粗产品的纯化工作。引入的功能机团有Q(强碱性)、SP、DEAE、CM四种。此外，Sepharose High Performnce(Sepharose HP)有Q-Sepharose HP和SP-Sepharose HP两种，颗粒细、分辨率高，理化稳定性好，流速和载量均适合于实验室或大量制备使用。Bio-GelA系离子交换剂：有DEAE-Bio-GelA和CM-Bio-GelA两种，回收率极高，床体积随pH和离子强度变化小，pH和化学稳定性好。(4)Source(4)Source系列离子交换剂系列离子交换剂 有Q(强碱型的)和S(强酸型)两种，是低压层析系统中分辨率最高，流速最快的离子交换剂，理化稳定性极好，可用1mol/L HCl和1mol/L NaOH在床清洗，使用寿命长，样品回收率高，重复性好，工艺放大容易。(5)Mono Beads(5)Mono Beads系列离子交换剂系列离子交换剂 是Pharmacia(GE)公司推出的新型交换剂，以亲水性聚醚为基质，能快速分离蛋白质，肽和低聚核苷酸，动态载样量大，可分离从mg到g的单克隆抗体。(二二)离子交换剂的选择离子交换剂的选择 任何一种离子交换剂都不可能适用于分离所有的样品。因此，选择理想的离子交换剂是提高有效成分的得率和分辨率的一个重要环节。1.1.阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择 如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如果被分离物质带负电荷，则应选择阴离子交换剂；如果被分离物质为两性离子，要按照其稳定状态的净电荷来选择交换剂。假设一蛋白质的等电点为5，若该物质在pH5-8稳定时，应选择阴离子交换剂；若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。2.2.强、弱离子交换剂的选择强、弱离子交换剂的选择 一般来说，强离子交换剂适用的pH范围很广。所以常用它来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。而弱性离子交换剂适用的pH范围较窄，在pH为中性的溶液中交换容量也高，用于分离生物大分子物质时，其活性不易丧失。所以，分离生物样品多采用弱离子交换剂。3.3.反离子的选择反离子的选择 离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。所此，强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。4.4.基质的选择基质的选择 树脂基质是疏水性化合物，而纤维素、葡聚糖和琼脂糖基质则是亲水性化合物。在分离生物大分子时，亲水性基质交换容量高，且对生物大分子物质的吸附和洗脱都比较温和，被分离物质活性不易受到破坏。要恰当地选择离子交换剂，必须对被分离物的性质和所处溶液组分及酸碱度等因素进行全面分析。综合考虑上述4个方面，选择的离子交换剂才能成功地分离样品。三、操作三、操作 1.1.离子交换剂的处理、再生和转型离子交换剂的处理、再生和转型 取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待充分膨胀后加大量的水悬浮除去细颗粒，尔后改用酸碱浸泡，以便除去杂质和使其带上需要的反离子。疏水性离子交换剂可以用2-4倍的2mol/L NaOH或2mol/L HCl溶液处理；而亲水性离子交换剂则只能用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理(室温下处理30分钟)。酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。在每次用酸(或碱)处理后，均应先用水洗涤至近中性，再用碱(或酸)处理。末了用水洗涤至中性，经缓冲液平衡后即可使用或装柱。使用过的离子交换剂，可采用一定的方法使其恢复原来的性状，这一过程叫做再生。再生可以通过上述的酸、碱反复处理完成，但有时也可以通过转型处理完成。所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转为另一种反离子的过程。比如，欲使阳离子交换剂转成钠型时，则需用NaOH处理；欲使其转成氢型时，则需用HCl处理；欲使其带铵离子时，则需用NH4OH或NH4Cl处理。长期使用过的树脂含有很多杂质，欲将其除掉，应先用沸水处理，然后用酸、碱处理。用热的稀酸、稀碱处理效果更好。树脂若含有脂溶性杂质时，可用乙醇或丙酮处理。而长期使用过的亲水性离子交换剂的处理一般只用酸、碱浸泡即可。原则上讲，去除杂质的过程应在不破坏离子交换剂的结构和稳定性，不影响其原有交换容量的前提下进行。2.2.缓冲液的选择缓冲液的选择 离子交换剂不仅可以与被分离物进行交换，而且还可以与缓冲液中的离子进行交换。因此，离子交换剂吸附被分离物的量与缓冲液的pH值和离子浓度有密切关系。起始缓冲液pH值和离子强度要能使样品中有效成分与离子交换剂结合，而杂质与交换剂不结合，则pH值一般比有效成分的pI高一个单位(用阴离子交换剂)或低一个单位(用阳离子交换剂)，离子强度为0.1时，就可很快地把有效成分与杂质分开。或者选择起始缓冲液的离子强度和pH值，使有效成分与离子交换剂结合得不牢固，而杂质与离子交换剂结合得牢固，也能得到高纯度有效成分。选用的洗脱液，其离子强度和pH值应使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般离子强度要比起始缓冲液高，pH值要按离子交换剂性质来选择。3.3.被分离物质的交换被分离物质的交换 使用离子交换剂的方法有两种：一种是柱层析法，也叫动态法，即将离子交换剂装入层析柱内，让溶液连续通过。该法交换效率高，应用范围广；另一种是分批法，也叫静态法，即将离子交换剂置入盛溶液的容器内缓慢地搅拌。该法交换率低，不能连续进行，但是，需要的设备简单，操作容易。柱层析法装柱的操作和要求与吸附柱层析相同。离子交换剂的总用量要依据其交换容量和待吸附物质的总量(包括连续使用的全部量)来计算。当溶液含有各种杂质时，必须考虑使交换量留有充分余地，实际交换量只能按理论交换量的25%-50%计算。在样品纯度极低，或有效成分与杂质的性质相似时，则实际交换量应控制得更低些。层析柱高与直径比例一般要大于101，分离样品的成分复杂时，比例宜高一些，用于样品浓缩和脱盐时，比例可低一些。4.4.被分离物质的洗脱与收集被分离物质的洗脱与收集 在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。梯度溶液按组成来分，一般有二种：一种是增加离子强度的梯度溶液。是用一简单的盐(如NaCl或KCl)溶解于稀缓冲液制成的，习惯上不用弱酸或弱碱的盐类；另一种是改变pH 值的梯度溶液。该溶液是用两种不同pH值或不同缓冲容量的缓冲液制成的，所用缓冲液的种类、pH值以及缓冲容量要认真选择，否则将达不到预期目的。对于增加离子强度的梯度溶液，不管用于何种类型的离子交换剂，其离子强度绝大部分是增加的。而改变pH值的梯度溶液则不然，如果使用的是阳离子交换剂，pH值应从低到高递增；如果使用的是阴离子交换剂，pH值应从高到低递减，实际许可的pH值范围由待分离物质的稳定pH范围和离子交换剂限制的pH范围来决定。离子强度线性梯度洗脱和阶段离子强度线性梯度洗脱和阶段洗脱分离牛血清蛋白图谱洗脱分离牛血清蛋白图谱 离子强度阶段洗脱和线性梯度离子强度阶段洗脱和线性梯度洗脱效果对比洗脱效果对比梯度的形状及产生装置梯度的形状及产生装置 1.在选择梯度的形状时，如果是对目的物首次进行离子交在选择梯度的形状时，如果是对目的物首次进行离子交换分离，强烈建议采用线性梯度换分离，强烈建议采用线性梯度.2.凸形梯度有利于改善梯度末尾部分的分辨率，对于一份凸形梯度有利于改善梯度末尾部分的分辨率，对于一份混合样品，如果开始阶段几个洗脱峰之间能够很好的分离，混合样品，如果开始阶段几个洗脱峰之间能够很好的分离，而末尾部分的几个组分吸附能力比较接近时，采用凸形梯而末尾部分的几个组分吸附能力比较接近时，采用凸形梯度既有利于末尾部分组分的分离度既有利于末尾部分组分的分离.3.凹形梯度有利于改善梯度起始阶段的分辨率，如果混合凹形梯度有利于改善梯度起始阶段的分辨率，如果混合样品起始部分组分吸附能力比较接近而末尾部分容易分开，样品起始部分组分吸附能力比较接近而末尾部分容易分开，采用凹形梯度能达到改善分辨率和缩短分离时间的效果。采用凹形梯度能达到改善分辨率和缩短分离时间的效果。除了梯度的形状，梯度的高度和斜率也影响着分离的速度除了梯度的形状，梯度的高度和斜率也影响着分离的速度和效果。梯度的斜率是指梯度的高度与完成此梯度时所用和效果。梯度的斜率是指梯度的高度与完成此梯度时所用洗脱剂体积（或时间）的比值。洗脱剂体积（或时间）的比值。在洗脱过程中，流速会影响到待分离物质的分辨率。在洗脱过程中，流速会影响到待分离物质的分辨率。梯度斜率对分辨率的影响梯度斜率对分辨率的影响 流速对分辨率的影响流速对分辨率的影响 洗脱液的离子强度和酸碱度的变化速率会影响层析的效果。当被分离物之间的选择系数相差较小时，洗脱液的离子强度或酸碱度的变化速度小些，有利于分辨率的提高，但各组分的峰形过宽时，可通过适当增加梯度斜率来克服。若各组分的选择系数差别大，有些组分不易洗脱时，洗脱液的离子强度或酸碱度变化率要大些。经洗脱流出来的溶液可用部分收集器分部收集，每管体积一般以柱体积的1-2%为宜。降低分部收集体积，可提高分辨率。分部收集的溶液经过检测分析，便可得知所含物质的数量。以此为纵坐标，以相应的洗脱体积为横坐标，能绘制出洗脱曲线。若被分离物可以用合适的检测器检测，则可使洗脱液流经检测器的比色池，用记录仪绘制洗脱曲线，如蛋白质和核酸可用紫外检测器分别检测A280或A260 谢谢大家！