基因工程原理与技术-5

第五章第五章 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)PCR是体外快速扩增目标是体外快速扩增目标DNA序列的技术序列的技术 1971年年Khorana等等提出提出“在体外经在体外经DNA变性，与适当引变性，与适当引物杂交，再用物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆聚合酶延伸，克隆DNA”的设想。的设想。1983年年Mullis发明了发明了PCR技术。技术。1988年年Saiki等等将耐热将耐热Taq DNA聚合酶引入了聚合酶引入了PCR技术技术。1989年年PCR被美国被美国Science杂志列为十余项重大科学杂志列为十余项重大科学发明之首。发明之首。1993年年Mullis荣获诺贝尔化学奖。荣获诺贝尔化学奖。应用领域应用领域：生命科学、医学、法医学及考古学。生命科学、医学、法医学及考古学。第一节第一节 PCR原理原理遵循遵循DNA体内复制原体内复制原理，半保留式扩增；理，半保留式扩增；扩增序列取决于设计扩增序列取决于设计一对引物一对引物(正向引物正向引物、反反向引物向引物)，有效扩增长度，有效扩增长度为为2kb左右；左右；扩增循环包含扩增循环包含变性变性、退火退火、延伸延伸3个阶段；个阶段；3035个循环后，目个循环后，目标序列呈指数级扩增标序列呈指数级扩增(2n-2)Cycle#1第二节第二节 PCR反应体系反应体系一、反应体系一、反应体系20l 反应体系反应体系10buffer(Tris-HCl、KCl、Tween20、明胶、牛血清蛋白、明胶、牛血清蛋白)dNTP(各各20200 mol/L)模板模板DNA(0.12 g=105个分子个分子)引物引物(各各20200pmol)MgCl2(0.52.5mmol/L)Taq DNA聚合酶聚合酶(12.5U)无菌无菌ddH2O二、反应参数二、反应参数 预变性：预变性：94 35 min变性：变性：94 3060 S退火：退火：3865 3060 S 延伸：延伸：72 12 min 终延伸：终延伸：72 10min 3035次循环次循环三、影响三、影响PCR的因素的因素1、反应成分反应成分 引物引物；浓度、长度；浓度、长度 DNA聚合酶聚合酶；种类；种类(Klenow酶、酶、Taq酶、酶、Pfu酶酶)、用量、用量 dNTP；浓度、比例；浓度、比例 Mg2+；影响；影响Taq DNA聚合酶的活性和真实性、引物退聚合酶的活性和真实性、引物退火、模板解链温度、产物的特异性、引物二聚体生成等。火、模板解链温度、产物的特异性、引物二聚体生成等。反应缓冲液反应缓冲液；pH8.3，KCl能促使引物退火、但浓度大能促使引物退火、但浓度大于于50mmol/L抑制酶活性。抑制酶活性。模板模板DNA。用量，线性。用量，线性DNA扩增效果大于环状扩增效果大于环状DNA。2、反应条件反应条件 变性的温度和时间变性的温度和时间；热启动热启动降低非特异性扩增降低非特异性扩增 退火的温度退火的温度和时间和时间；取决于引物的长度、浓度和碱基；取决于引物的长度、浓度和碱基组成，退火温度为组成，退火温度为Tm-5。退火温度越高，扩增特异性越退火温度越高，扩增特异性越高。高。延伸温度和时间延伸温度和时间。延伸时间长短取决于目标序列的长延伸时间长短取决于目标序列的长度、及延伸温度的高低。对度、及延伸温度的高低。对2 kb长目标序列扩增时间多采用长目标序列扩增时间多采用 1min(72 时时)。四、平台效应四、平台效应 平台效应平台效应是指是指PCR反应后期扩增产物不再随循环次数而反应后期扩增产物不再随循环次数而明显上升、反应曲线明显上升、反应曲线变得平坦变得平坦的现象。的现象。引起平台效应的因素引起平台效应的因素：dNTP或引物等消耗殆尽；或引物等消耗殆尽；酶活性逐渐降低；酶活性逐渐降低；最终产物的阻化作用最终产物的阻化作用(焦磷酸盐、双链焦磷酸盐、双链DNA)；非特异性产物与模板的竞争作用；非特异性产物与模板的竞争作用；在高产物浓度下产物变性不完全；在高产物浓度下产物变性不完全；低浓度的非特异产物开始大量扩增。低浓度的非特异产物开始大量扩增。PCR的特点的特点：灵敏度高灵敏度高 简便、快速简便、快速 对样品纯度要求低对样品纯度要求低 第三节第三节 聚合酶链式反应引物设计原则聚合酶链式反应引物设计原则一、引物设计的总原则一、引物设计的总原则 提高特异性扩增，降低非特异性扩增提高特异性扩增，降低非特异性扩增。二、引物设计的一般原则二、引物设计的一般原则 引物长度应为引物长度应为1530个核苷酸个核苷酸，Tm接近接近72较佳；较佳；Tm(GC)4(AT)2 引物中碱基分布应是随机的引物中碱基分布应是随机的，避免出现一连串单一碱，避免出现一连串单一碱基以致产生二级结构；基以致产生二级结构；GC碱基的含量在碱基的含量在 4555左右左右；引物引物3端必须与模板互补端必须与模板互补，5端可以不互补端可以不互补 引物中连续互补碱基应小于引物中连续互补碱基应小于4个个；引物间连续互补碱基应小于引物间连续互补碱基应小于4个个。三、引物三、引物3端的末位碱基端的末位碱基 引物引物3端的未位碱基：优选端的未位碱基：优选A，其次是，其次是G、C，不要选，不要选T。因为当未位碱基为因为当未位碱基为T时，即使在错配的情况下也能引发链的时，即使在错配的情况下也能引发链的合成；而未位碱基为合成；而未位碱基为A时，错配时的引发效率大大降低；若时，错配时的引发效率大大降低；若为为G或或C，则引发率居于其间。当然，设计，则引发率居于其间。当然，设计简并引物简并引物时，时，3端末位碱基选端末位碱基选T会得到较好的效果。会得到较好的效果。四、引物设计软件四、引物设计软件 Oligo6.57 Primer 5.0 第四节第四节 PCR的类型的类型一、已知一、已知DNA序列的序列的PCR扩增扩增1、巢式、巢式PCR 不受平台效应限制，扩增灵敏度增加不受平台效应限制，扩增灵敏度增加1000倍，倍，引物引物1引物引物225个循环个循环引物引物3引物引物425个循环个循环2、热巢式、热巢式PCR 第二对引物之一标记放射性物质，电泳检测时灵敏度增第二对引物之一标记放射性物质，电泳检测时灵敏度增高，可测出高，可测出106个细胞中的一个个细胞中的一个 DNA分子。分子。3、半巢式、半巢式PCR(见下图见下图)引物引物1引物引物225个循环个循环25个循环个循环引物引物1引物引物34、不对称、不对称PCR 采用两种不同浓度的引物采用两种不同浓度的引物(50:1)。主要用于主要用于制备制备DNA测序的测序的单链单链模板模板以及以及制备杂交探针制备杂交探针。高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物5、等位特异性、等位特异性PCR 用于检测点突变用于检测点突变。在引物的。在引物的 3端设计了突变碱基，突变端设计了突变碱基，突变引物与正常模板间扩增受阻，电泳分析时，不出现谱带，反引物与正常模板间扩增受阻，电泳分析时，不出现谱带，反之则会出现特定谱带。但有些错配碱基不能完全阻止引物延之则会出现特定谱带。但有些错配碱基不能完全阻止引物延伸。伸。6、竞争引物、竞争引物PCR 用于用于检测特定位点的点突变检测特定位点的点突变。设计两个等位特异性引物，。设计两个等位特异性引物，一个是正常的，另一个是突变引物，而且一个是正常的，另一个是突变引物，而且突变碱基在引物中突变碱基在引物中间间，其扩增产物相差其扩增产物相差20倍以上。由于倍以上。由于一个引物被标记一个引物被标记，能检，能检测出不同样品的的扩增差异。测出不同样品的的扩增差异。常为常为A/A、G/G、G/A、C/A、C/C、T/C、T/G。7、降落、降落PCR 在一次在一次PCR中，设计多循环反应的程序，第一个程序中，设计多循环反应的程序，第一个程序的退火温度高于的退火温度高于Tm，以后每个程序的退火温度逐渐降低，以后每个程序的退火温度逐渐降低，确保第一次扩增的特异性，这样后面的低退火温度不会影确保第一次扩增的特异性，这样后面的低退火温度不会影响扩增的特异性，因为在开始的几个循环中，目标产物已响扩增的特异性，因为在开始的几个循环中，目标产物已指数级扩增。常用于指数级扩增。常用于根据氨基酸序列设计简并引物的扩增、根据氨基酸序列设计简并引物的扩增、多基因家族成员的扩增多基因家族成员的扩增。二、逆转录二、逆转录PCR(RT-PCR)逆转录逆转录PCR是指先以是指先以mRNA，以，以oligo(dT)n为引物在逆为引物在逆转录酶作用下合成转录酶作用下合成cDNA第一链，然后用已知一对引物扩增第一链，然后用已知一对引物扩增cDNA片段的技术。片段的技术。主要用于主要用于基因表达基因表达、cDNA克隆克隆、逆转录病毒鉴定逆转录病毒鉴定等研等研究。究。反转录反转录PCRRT-PCR 引物设计原则：引物设计原则：引物限定区最好为引物限定区最好为180500bp；引物引物5和和3端不应存在回文序列结构；端不应存在回文序列结构；用用oligo(dT)n作逆转录第一链作逆转录第一链cDNA的引物时，有义引的引物时，有义引物应尽量位于物应尽量位于RNA的的3端；端；在引物限定区内，基因组在引物限定区内，基因组DNA最好有一内含子，这最好有一内含子，这样可检测污染情况；样可检测污染情况；PCR引物限定区内最好有一酶切位点，以便鉴定产物；引物限定区内最好有一酶切位点，以便鉴定产物；三、快速扩增三、快速扩增cDNA末端末端(RACE，锚定锚定PCR)杂合引物杂合引物:17nt oligo(dT)(锚定引锚定引物物)+带限制酶位带限制酶位点的序列。点的序列。基因特异引物基因特异引物5RACE的缺点：的缺点：不能获得真正的不能获得真正的5末端末端。因为过早。因为过早终止第一链终止第一链cDNA像全长像全长cDNA一样，一样，可被末端转移酶可被末端转移酶同样有效地加尾。同样有效地加尾。3RACE5RACE新新5RACE(加帽法加帽法)杂合引物RNA、RNA连接酶5RACE烟草酸性焦磷酸酶 四、已知序列的侧翼未知序列的四、已知序列的侧翼未知序列的PCR扩增扩增1、反向反向PCR 酶切位点已知序列酶切稀释并分子内连接 引物PCR在已知序列内酶切PCR2、锅柄、锅柄PCR 酶切、磷酸酶处理连接单连引物加Taq酶和dNTP，变性链内复性（稀释）链延伸链延伸巢式PCR已知序列引物巢式PCR五、未知序列五、未知序列PCR扩增扩增1、差异显示、差异显示PCR 锚定引物锚定引物N9：随机引物：随机引物2、减法、减法PCR例如：受试者为感病材例如：受试者为感病材料；驱动者为正常材料料；驱动者为正常材料六、荧光定量六、荧光定量PCR (实时定量实时定量PCR)荧光染料荧光染料(EB)：结合：结合双链双链DNA会使荧光增强，会使荧光增强，但结合无特异性。但结合无特异性。荧光标记探针荧光标记探针(见图见图)：利用：利用Taq酶的外切酶活酶的外切酶活性，扩增时切断探针释性，扩增时切断探针释放出荧光基团，使荧光放出荧光基团，使荧光增强。特异性强增强。特异性强 用途用途：检测病原菌检测病原菌、基因表达。基因表达。R：荧光基团；Q：淬灭基团第五节第五节 PCR技术应用技术应用一、一、基因克隆及筛选基因克隆及筛选二、二、基于基于PCR分子标记分子标记 RAPD、SSR、AFLP等，应用在遗传图谱构建、生物进等，应用在遗传图谱构建、生物进化、遗传多样性等方面的研究。化、遗传多样性等方面的研究。三、三、DNA测序测序四、四、突变检测突变检测五、五、基因表达检测基因表达检测六、六、病原菌检测与疾病诊断病原菌检测与疾病诊断七、七、法医鉴定法医鉴定 犯罪嫌疑人鉴定犯罪嫌疑人鉴定(见下图见下图)、亲子鉴定亲子鉴定八、八、转基因检测转基因检测 转基因育种转基因育种、进口农产品进口农产品九、其它九、其它1.5.9.Marker1.5.9.Marker，8 8是对照是对照2.2.嫌疑人嫌疑人A A血细胞血细胞DNADNA3.3.被害人衣服上残留精液被害人衣服上残留精液DNADNA4.4.嫌疑人嫌疑人B B血细胞血细胞DNADNA6.6.被害人阴道取样被害人阴道取样DNADNA7.7.被害人血被害人血DNADNA8.8.实验对照实验对照