转基因生物和基因打靶课件

转基因生物和基因打靶转基因动物转基因动物(transgenic animal)用人工方法将外源基因导入或整合到基用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物因组内，并能稳定传代的一类动物特点特点分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达表达2021/2/422021/2/43基本原理基本原理目的基因目的基因 显微注射显微注射 受精卵或胚胎细胞受精卵或胚胎细胞 整合整合 植入输卵管植入输卵管 外源基因：顺式作用元件外源基因：顺式作用元件 结构基因结构基因 报报告基因告基因(report gene)融合基因融合基因2021/2/44基本方法基本方法显微注射法显微注射法胚胎干细胞法胚胎干细胞法(embryonic stem cells,ES细胞细胞)逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法精子载体法精子载体法转基因动物中外源基因的检测转基因动物中外源基因的检测染色体及基因水平：斑点杂交、染色体及基因水平：斑点杂交、Southern杂交、杂交、PCR转录水平：转录水平：Northern杂交杂交蛋白质水平：蛋白质水平：Western印迹印迹2021/2/452021/2/462021/2/472021/2/482021/2/492021/2/4102021/2/4112021/2/412转基因动物的应用转基因动物的应用基因特异表达的研究基因特异表达的研究发现基因的新功能发现基因的新功能发现新基因发现新基因建立基因表达、调控的动物模型建立基因表达、调控的动物模型建立人类疾病的动物模型等建立人类疾病的动物模型等2021/2/4132021/2/4142021/2/4152021/2/416转基因植物转基因植物(transgenic plant)基本方法基本方法获得目的基因获得目的基因受体细胞培养：如植物愈伤组织等受体细胞培养：如植物愈伤组织等目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞培养转化细胞培养转化细胞筛选、培植、鉴定筛选、培植、鉴定农杆菌介导的基因转移：农杆菌介导的基因转移：冠瘿瘤冠瘿瘤 Ti质粒质粒(tumor-in-ducing plasmid)转移转移DNA(transfer DNA,T-DNA)2021/2/417转基因植物在医学上的应用转基因植物在医学上的应用生产药用蛋白生产药用蛋白生产新的疫苗等生产新的疫苗等转基因植物的安全性探讨转基因植物的安全性探讨2021/2/418基因打靶基因打靶(gene targeting)通过通过DNA定点同源重组，改变基因组中定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。基因的功能。基因敲除基因敲除(gene knockout)：定向敲除：定向敲除基因敲入基因敲入(gene knockin)：定向替代：定向替代2021/2/419基因打靶的必备条件基因打靶的必备条件胚胎干细胞胚胎干细胞(ES细胞细胞)能在体外培养，保留发育的全能性能在体外培养，保留发育的全能性打靶载体打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志（新霉素）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)2021/2/420基因敲除的基本程序基因敲除的基本程序打靶载体的构建打靶载体的构建打靶载体导入打靶载体导入ES细胞：重组置换细胞：重组置换基因敲除基因敲除ES细胞注射入胚泡细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种嵌合体的杂交育种2021/2/4212021/2/422基因打靶在医学中的应用基因打靶在医学中的应用基因打靶与遗传病基因打靶与遗传病基因打靶与肿瘤的研究基因打靶与肿瘤的研究基因打靶与生物制药基因打靶与生物制药2021/2/423第十四章第十四章 基因与疾病基因与疾病基因结构异常的分子机制基因结构异常的分子机制基因结构变异与异常血红蛋白病基因结构变异与异常血红蛋白病基因结构变异与地中海贫血基因结构变异与地中海贫血基因结构变异与血友病甲基因结构变异与血友病甲基因结构变异与血友病乙基因结构变异与血友病乙2021/2/424基因结构异常的分子机制基因结构异常的分子机制DNA一级结构变异的分子机制一级结构变异的分子机制自发突变；诱发突变自发突变；诱发突变诱变因素：诱变剂诱变因素：诱变剂*碱基和核苷类似物：碱基和核苷类似物：5-氟尿嘧啶；氟尿嘧啶；6-巯基嘌呤巯基嘌呤*烷化剂：氮芥、环磷酰胺；活性烷基烷化剂：氮芥、环磷酰胺；活性烷基*抗生素类：放线菌素抗生素类：放线菌素D*染色剂：吖啶黄染色剂：吖啶黄*亚硝酸盐亚硝酸盐*电离辐射和紫外线照射电离辐射和紫外线照射2021/2/425诱变剂的作用机制诱变剂的作用机制碱基类似物诱发突变碱基类似物诱发突变取代天然化合物，引起配对错误，如取代天然化合物，引起配对错误，如5-嗅尿嗅尿嘧啶使嘧啶使A-T变变G-C改变改变DNA的化学结构的化学结构亚硝酸盐（亚硝酸盐（HNO2），氧化脱氨），氧化脱氨结合到结合到DNA上诱发移码突变：如吖啶类上诱发移码突变：如吖啶类紫外线及其它射线引起的紫外线及其它射线引起的DNA分子的变分子的变化化2021/2/426突变类型及其遗传效应突变类型及其遗传效应突变类型突变类型点突变：转换，颠换；缺失；插入；倒位点突变：转换，颠换；缺失；插入；倒位突变的遗传效应：改变了突变的遗传效应：改变了DNA的碱基排的碱基排列顺序列顺序遗传密码的改变：错义突变；无义突变；同遗传密码的改变：错义突变；无义突变；同义突变；移码突变义突变；移码突变对对mRNA剪接的影响剪接的影响蛋白质肽链中的片段缺失蛋白质肽链中的片段缺失2021/2/4272021/2/4282021/2/4292021/2/4302021/2/4312021/2/4322021/2/4332021/2/434基因结构变异与异常血红蛋白病基因结构变异与异常血红蛋白病血红蛋白血红蛋白(Hb)变异的分子基础变异的分子基础单个碱基替代单个碱基替代密码子的缺失与嵌入密码子的缺失与嵌入移码突变移码突变终止密码突变终止密码突变融合基因融合基因2021/2/435不稳定血红蛋白病不稳定血红蛋白病成因成因与血红素接触的氨基酸发生了置换：疏水的与血红素接触的氨基酸发生了置换：疏水的“血红素口袋血红素口袋”在在-螺旋上的氨基酸发生了替代螺旋上的氨基酸发生了替代11接触面上的氨基酸发生置换接触面上的氨基酸发生置换氨基酸缺失氨基酸缺失结果：血红素脱下，排出；珠蛋白，亨结果：血红素脱下，排出；珠蛋白，亨氏小体，溶血性贫血氏小体，溶血性贫血2021/2/436血红蛋白血红蛋白M病病高铁血红蛋白（高铁血红蛋白（Hb M）：珠蛋白点突变，）：珠蛋白点突变，His被被Tyr取代，氧亲和力下降，紫绀取代，氧亲和力下降，紫绀伴有红细胞增多症的异常血红蛋白病伴有红细胞增多症的异常血红蛋白病位于位于12接触面上的氨基酸发生取代接触面上的氨基酸发生取代位于珠蛋白肽链羧基端的氨基酸间不能形成位于珠蛋白肽链羧基端的氨基酸间不能形成盐桥盐桥氨基酸取代影响氨基酸取代影响链与链与2,3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸(2,3-DPG)的结合的结合“血红素口袋血红素口袋”四周的氨基酸被取代四周的氨基酸被取代2021/2/4372021/2/4382021/2/4392021/2/4402021/2/4412021/2/4422021/2/443基因结构变异与地中海贫血基因结构变异与地中海贫血地中海贫血：珠蛋白肽链合成受到抑制地中海贫血：珠蛋白肽链合成受到抑制所引起的溶血性贫血所引起的溶血性贫血-地中海贫血：地中海贫血：链的合成受到抑制链的合成受到抑制-珠蛋白基因家族：珠蛋白基因家族：类：类：和和；类：类：、和和-地中海贫血的分子基础地中海贫血的分子基础2021/2/444-地中海贫血地中海贫血原因：原因：链的合成明显减少或完全不能合成链的合成明显减少或完全不能合成突变对基因表达的影响：突变对基因表达的影响：转录水平降低转录水平降低RNA剪接异常剪接异常翻译缺陷翻译缺陷RNA修饰缺陷修饰缺陷生成不稳定的生成不稳定的珠蛋白珠蛋白基因缺失引起的基因缺失引起的0-地中海贫血地中海贫血2021/2/4452021/2/4462021/2/4472021/2/4482021/2/449基因结构变异与血友病甲基因结构变异与血友病甲“经典经典”血友病：血友病：X染色体连锁，自发性出染色体连锁，自发性出血血病因：因子病因：因子活性缺乏，因子活性缺乏，因子基因基因的缺陷的缺陷基因缺失基因缺失插入突变插入突变点突变点突变基因重排基因重排2021/2/450基因结构变异与血友病乙基因结构变异与血友病乙性连锁遗传性出血性疾病，因子性连锁遗传性出血性疾病，因子缺乏缺乏因子因子基因缺陷基因缺陷基因缺失基因缺失基因插入基因插入RNA剪接部位突变剪接部位突变无义突变无义突变错义突变错义突变2021/2/451谢谢大家！