国内外沙门氏菌检测方法

1会计学国内外沙门氏菌检测方法国内外沙门氏菌检测方法DANIEL ELMER SALMON,(1850-1914)美国兽医微生物和病理学家。是美美国兽医微生物和病理学家。是美国授予的第一位兽医学博士。国授予的第一位兽医学博士。1881884 4年任美国农业部畜牧局年任美国农业部畜牧局 首任局长。首任局长。他首次从病猪中分离出猪霍乱沙门他首次从病猪中分离出猪霍乱沙门氏菌。在医学微生物中通用的沙门氏菌。在医学微生物中通用的沙门菌一词，就是为纪念他而以菌一词，就是为纪念他而以 他的名他的名字命名的。字命名的。沙门菌（沙门菌（Salmonella）第1页/共38页沙门菌（沙门菌（Salmonella）沙门菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门杆菌。第2页/共38页沙门菌（沙门菌（Salmonella）目前至少有目前至少有目前至少有目前至少有67676767种种种种O O O O抗原和抗原和抗原和抗原和2000200020002000个以上血清型，所致疾病称沙门个以上血清型，所致疾病称沙门个以上血清型，所致疾病称沙门个以上血清型，所致疾病称沙门菌病。菌病。菌病。菌病。肠热症：是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、肠热症：是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、肠热症：是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、肠热症：是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。乙、丙型副伤寒杆菌引起。乙、丙型副伤寒杆菌引起。乙、丙型副伤寒杆菌引起。急性肠炎急性肠炎急性肠炎急性肠炎(食物中毒食物中毒食物中毒食物中毒):):):):是最常见的沙门杆菌感染。多由鼠伤是最常见的沙门杆菌感染。多由鼠伤是最常见的沙门杆菌感染。多由鼠伤是最常见的沙门杆菌感染。多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。败血症：常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、败血症：常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、败血症：常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、败血症：常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌等引起。肠炎杆菌等引起。肠炎杆菌等引起。肠炎杆菌等引起。第3页/共38页 大小大小大小大小0.60.60.60.61.021.021.021.023um3um3um3um，无芽胞，一般有鞭毛无芽胞，一般有鞭毛无芽胞，一般有鞭毛无芽胞，一般有鞭毛(鸡鸡鸡鸡沙门菌除外沙门菌除外沙门菌除外沙门菌除外)，无荚膜，无荚膜，无荚膜，无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性多数有菌毛，革兰氏阴性多数有菌毛，革兰氏阴性多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌杆菌杆菌杆菌，需氧或兼性厌氧，需氧或兼性厌氧，需氧或兼性厌氧，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为最适生长温度为最适生长温度为最适生长温度为3535353537373737，最适，最适，最适，最适pHpHpHpH值为值为值为值为6.86.86.86.87.87.87.87.8。沙门菌生物学性状沙门菌生物学性状第4页/共38页不分解乳糖（亚利桑那菌除不分解乳糖（亚利桑那菌除外）。分解葡萄糖产酸产气外）。分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。（伤寒沙门菌产酸不产气）。多数产生多数产生H H2 2S S，不产生靛基质，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。培养基上不生长。沙门菌生物学性沙门菌生物学性状状第5页/共38页沙门菌常用生化试验沙门菌常用生化试验三糖铁（TSI）尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）第6页/共38页沙门菌常用生化试验沙门菌常用生化试验吲哚试验阴性（液面黄）阳性（液面红）VP试验 阳性（红色）阴性（不变）第7页/共38页沙门菌常用生化试验沙门菌常用生化试验赖氨酸脱羧酶试验对照 阳性（紫）阴性（黄）丙二酸盐试验阳性（兰）阴性（不变）第8页/共38页ONPG试验阳性（黄）空白沙门菌常用生化试验第9页/共38页国内外沙门菌检测方法（传国内外沙门菌检测方法（传统方法）统方法）国家标准国家标准国家标准国家标准行业标准行业标准行业标准行业标准FDA FDA （Food&Drug AdministrationFood&Drug Administration）AOAC(Association of Official Analytical Chemists)AOAC(Association of Official Analytical Chemists)FSIS FSIS （FOOD SAFETY AND INSPECTION FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICESERVICE）ISOISO加拿大官方食品微生物分析方法加拿大官方食品微生物分析方法加拿大官方食品微生物分析方法加拿大官方食品微生物分析方法 第10页/共38页冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品前增菌法前增菌法25gBPW225mL36 1 一般4h，干蛋品18h24h10mLMM（或（或TTB）100mL10mLSC100mL直接增菌法直接增菌法25g灭菌生理盐水灭菌生理盐水25mL检样匀液检样匀液25mL MM（或（或TTB）100mL检样匀液检样匀液25mL SC100mLBSDHL（或（或HE、WS、SS）TSI（排除排除A/A H2S结果结果），靛基质，尿素，靛基质，尿素，KCN，赖氨酸，赖氨酸沙门氏菌血清学试验沙门氏菌血清学试验甘露醇 山梨醇H2S 靛靛 尿尿KCN 赖赖H2S 靛靛 尿尿KCN 赖赖/非如左述的各种反应结果非如左述的各种反应结果沙门氏菌血清学试验沙门氏菌血清学试验 ONPG 沙门氏菌沙门氏菌非沙门氏菌非沙门氏菌42 18h24h36 1 18h24h42 18h24h36 1 18h24h36 1 40h48h36 1 18h24h 微生物学检验微生物学检验 沙门沙门氏菌检验氏菌检验中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准GB/T 4789.4-2003第11页/共38页 出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法菌）检验方法菌）检验方法菌）检验方法 肉类、蛋品肉类、蛋品缓冲胨水（缓冲胨水（BPW）四硫磺酸盐煌绿（四硫磺酸盐煌绿（TTB）亚硒酸盐胱氨酸（亚硒酸盐胱氨酸（SC）37 4h or 2024h直接选择性增菌亚硒酸盐胱氨酸（亚硒酸盐胱氨酸（SC）四硫磺酸盐煌绿（四硫磺酸盐煌绿（TTB）37 24 2h BS&DHL (亚利桑那菌琼脂亚利桑那菌琼脂)前增菌37 2448h TSI&赖氨酸脱羧酶赖氨酸脱羧酶TSI&尿素酶尿素酶 37 2448h生化试验生化试验血清学试验（血清学试验（“O”抗原，抗原，“Vi”抗原）抗原）42 20 2h 37 2448h结果判定结果判定检验检疫行业标准检验检疫行业标准SN 017092第12页/共38页 样品（样品（20类）类）25g225mL 乳糖肉汤（乳糖肉汤（LB）or 胰酪胨大豆肉汤（胰酪胨大豆肉汤（TSB）or 煌绿溶液煌绿溶液（BG）or通用前增菌肉汤（通用前增菌肉汤（UPB）or营养肉汤（营养肉汤（NB）or 再造脱脂奶粉再造脱脂奶粉 or 四硫酸盐煌绿（四硫酸盐煌绿（TT）pH6.80.2 242 h 35RVTT 430.2 or 352.0 242h 242h 420.2BS&XLD&HE 242h 35TSI&LIA非沙门菌非沙门菌沙门菌沙门菌非沙门菌非沙门菌LIA+LIA TSI K/ALIA TSI A/A&尿素酶，尿素酶，H抗原（多价抗原（多价H抗血清或抗血清或Spicer-Edwards flagellar(H)test），赖氨酸脱羧酶，），赖氨酸脱羧酶，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN，丙二酸盐，吲哚），丙二酸盐，吲哚），O抗原抗原酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MRVP,西蒙氏柠檬酸盐西蒙氏柠檬酸盐5种商业生化鉴定系统（API 20E,Enterotube II,Enterobacteriaceae II,MICRO-ID,or Vitek GNI）&O抗原&H抗原细菌学分析手册细菌学分析手册（FDA/BAM）第五章第五章 沙门菌属沙门菌属第13页/共38页肉、禽和蛋品中沙门菌的分离和鉴定肉、禽和蛋品中沙门菌的分离和鉴定USDA/FSIS MLG 4.02样品样品BPW or BPW（含结晶紫）含结晶紫）351 20-24hBGS&DMLIA or XLT442 0.5 2224h0.5 0.05mL10mL TT0.1 0.1 0.02 0.02mLmL10mL mRV10mL mRV42 0.5 2224h35 1 1824h&48hTSI&LIA血清学试验血清学试验商业生化试剂盒或自动鉴定系统商业生化试剂盒或自动鉴定系统 or传统生化鉴定（传统生化鉴定（AOAC Official Method 967.27 or Edwards and Ewings Identification of Enterobacteriaceae）报告结果报告结果第14页/共38页 肉制品中沙门菌的分离和鉴定肉制品中沙门菌的分离和鉴定 FDA&USDA/FSIS乳糖肉汤缓冲蛋白胨水TTB肉汤RV肉汤TTB肉汤RV肉汤BSXLDHEXLT42倍改良LIABGS生化筛选（LIA,TSI）鉴定及确证试验 葡萄糖 脲酶试验 卫矛醇 动力试验 吲哚 MR-VP测试 氰化钾 粉红酒石酸盐琼脂 乳糖 水杨苷 赖氨酸脱羧酶 西蒙氏枸橼酸盐 丙二酸 蔗糖血清学试验第15页/共38页AOAC沙门菌检测方法沙门菌检测方法AOAC Official Method 967.25AOAC Official Method 967.25SalmonellaSalmonella in Foods in FoodsPreparation of Culture Media and ReagentsPreparation of Culture Media and ReagentsAOAC Official Method 967.26AOAC Official Method 967.26SalmonellaSalmonella in Processed Foods in Processed FoodsDetectionDetectionAOAC Official Method 967.27AOAC Official Method 967.27SalmonellaSalmonella in Foods in FoodsIdentificationIdentificationAOAC Official Method 967.28AOAC Official Method 967.28SalmonellaSalmonella in Foods in FoodsSerological TestsSerological Tests第16页/共38页食品中的沙门菌检测方法食品中的沙门菌检测方法食品中的沙门菌检测方法食品中的沙门菌检测方法AOAC 967.25967.28处理样品处理样品1mL+10mLSC1mL+10mLTT35 242hXLD&HE&BS35 242h（BS 24h&48h）35 242hTSI&LIA35 242h纯培养物纯培养物不纯培养物不纯培养物纯培养物纯培养物MAC or XLD or HE尿素酶尿素酶尿素酶尿素酶非沙门菌非沙门菌H抗原，抗原，LIA，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN，丙二酸盐，吲哚），丙二酸盐，吲哚），O抗原抗原吲哚&H血清KCN&LIA非沙门菌非沙门菌非沙门菌非沙门菌补充生化试验酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MRVP,西蒙氏柠檬酸盐西蒙氏柠檬酸盐非沙门菌非沙门菌沙门菌沙门菌第17页/共38页25g样品样品225mL BPW35 or 37 1620 h0.1mL+10mL RV10mL+100mL SC42 24h35 or 37 24h&48h酚红煌绿琼脂酚红煌绿琼脂（亮绿琼脂）（亮绿琼脂）&第二种选择性平板第二种选择性平板35 or 37 2024h无典型菌落再培养无典型菌落再培养1824h典型菌落（典型菌落（pink red）营养琼脂纯化可疑菌落营养琼脂纯化可疑菌落每个平板选5个菌落35 or 37 1824hTSI，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，ONPG，VP，吲哚吲哚血清学试验血清学试验（O抗原，抗原，Vi抗原，抗原，H抗原）抗原）报告结果报告结果送参考实验室分型送参考实验室分型ISO 6579:1993(E)微生物沙门菌检测的通用方法微生物沙门菌检测的通用方法第18页/共38页25g样品样品营养肉汤营养肉汤or缓冲胨水缓冲胨水or煌绿煌绿 水溶液水溶液or胰蛋白酶大豆肉汤胰蛋白酶大豆肉汤35 1824 h1mL+9mL SC1mL+9mL TBG35 242h42.5 242hBS&BGS35 242h&48 2h纯培养物纯培养物不纯培养物不纯培养物纯培养物纯培养物MACTSI&LIA&尿素琼脂尿素琼脂O多价血清，多价血清，H多价血清多价血清食品中沙门菌的分离和鉴定食品中沙门菌的分离和鉴定加拿大加拿大HPB方法方法商业生化试剂盒或自动鉴定系统商业生化试剂盒或自动鉴定系统报告报告MFHPB-20第19页/共38页沙门菌仪器检测法沙门菌仪器检测法n nVIDAS（生物梅里埃公司）n nBAX（杜邦公司）第20页/共38页沙门菌仪器检测法沙门菌仪器检测法n nVIDASVIDAS 应用酶联免疫技术制造的全自动免疫分析仪应用酶联免疫技术制造的全自动免疫分析仪 ，用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体，用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高，速度快，可以在高，速度快，可以在4848小时的时间内快速鉴定沙小时的时间内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌门氏菌、大肠杆菌O157O157：H7H7、单核李斯特菌，空、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。第21页/共38页VIDAS 第22页/共38页沙门菌仪器检测法沙门菌仪器检测法n nDUPONT Qualicon BAX System 应用DNA分子核酸探针或基因探针技术制造的全自动PCR分析仪。将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的。第23页/共38页DUPONT Qualicon BAX System 第24页/共38页商品化生化鉴定系统商品化生化鉴定系统VITEK GNI+VITEK GNI+应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质。先制备一卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质。先制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬液接定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数功能种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的生基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的生物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结果。物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结果。第25页/共38页VITEK第26页/共38页商品化生化鉴定系统商品化生化鉴定系统n nAPI 20EAPI 20E API 20E API 20E 生化鉴定是根据快速酶促反应及代谢生化鉴定是根据快速酶促反应及代谢产物的检测技术发展的一种细菌编码鉴定法，广产物的检测技术发展的一种细菌编码鉴定法，广泛应用于临床、食品中革兰氏阴性杆菌的快速鉴泛应用于临床、食品中革兰氏阴性杆菌的快速鉴定。定。第27页/共38页API 20E第第1位位数数第第2位位数数第第3位位数数第第4位位数数第第5位位数数第第6位位数数第第7位位数数结结果果判判定定ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRGASACMELAMYARAOX1 2 41 2 41 2 4 1 2 41 2 41 2 41 2 4反反应应结结果果-+-+-+-+-沙沙门门菌菌应应得得树树枝枝0 2 41 2 40 0 0 0 0 41 2 41 0 40 2 0组组合合编编码码 6 7 0 4 7 5 2第28页/共38页API 20E第29页/共38页沙门氏菌在CHROMagar显色培养基上的菌落特（紫）沙门氏菌在海博公司显色培养基上的菌落特征（红）沙门菌检测显色培沙门菌检测显色培养基养基第30页/共38页第31页/共38页