大肠杆菌感受态细胞制备.ppt

一 、 实 验 目 的n 通 过 本 实 验 ， 掌 握 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞的 制 备 的 方 法 和 技 术 。 二 、 实 验 原 理n 感 受 态 细 胞 制 备 :所 谓 感 受 态 是 指 受 体 细 胞 处 于 容 易吸 收 外 源 DNA的 一 种 生 理 状 态 ， 可 以 通 过 物 理 与 化学 方 法 诱 导 形 成 ， 也 可 以 自 然 形 成 ， 在 基 因 工 程 技术 中 通 常 采 用 诱 导 的 方 法 。 用 于 转 化 的 受 体 菌 细 胞一 般 是 限 制 -修 饰 系 统 （ Restriction-Modification）缺 陷 的 变 异 株 ， 以 防 止 对 导 入 的 外 源 DNA的 切 割 ，用 符 号 R-M-表 示 。 二 、 实 验 原 理n 其 基 本 原 理 是 ： 细 菌 处 于 0 的 CaCl2低 渗 溶 液中 ， 会 膨 胀 成 球 形 ， 细 胞 膜 的 通 透 性 发 生 变 化 ，转 化 混 合 物 中 的 质 粒 DNA形 成 抗 DNase的 羟 基 -钙 磷 酸 复 合 物 黏 附 于 细 胞 表 面 ， 经 过 42 短 时间 的 热 激 处 理 ， 促 进 细 胞 吸 收 DNA复 合 物 ， 在丰 富 的 培 养 基 上 生 长 数 小 时 后 ， 球 状 细 胞 复 原 并分 裂 增 殖 ， 在 选 择 培 养 基 上 可 获 得 所 需 的 转 化 子 。 三 、 实 验 材 料 与 设 备n 1、 用 品 与 与 仪 器 ：n 超 净 工 作 台 、 恒 温 培 养 箱 、 移 液 器 、 微 型 离 心 管 等 、 台 式冷 冻 高 速 离 心 机 、 冰 箱 、 制 冰 机 等 ；n 1.5mL 与 0.5mL Eppendorf 管 、 tip头 、 烧 杯 、 量 筒 。 镊 子 、 试 管 三 角 瓶 、 玻 璃 涂 棒 、 酒 精 灯 、 无 菌 牙 签 、 吸水 纸 ， 一 次 性 塑 料 手 套 等 ； n E.coli DH5受 体 菌 (R-M-)， pGEX-4T-2质 粒 (Ampr)。 三 、 实 验 材 料 与 设 备n 2、 试 剂 ：n LB培 养 基 :蛋 白 胨 10g/L， 酵 母 提 取 物 5g/L， NaCl 10g/L，琼 脂 粉 15g/L（ 固 体 培 养 基 ） ， 用 10 mol/L的 NaOH调 节 pH为7.0， 高 压 灭 菌 ；n 氨 苄 青 霉 素 贮 存 液 ： 浓 度 50-100mg mL； n 含 有 抗 菌 素 的 LB平 板 培 养 基 ： 将 配 置 好 的 LB固 体 培 养 基 高 压灭 菌 后 ， 冷 却 到 60度 左 右 ， 加 入 氨 苄 青 霉 素 （ 终 浓 度 为 50g mL浓 度 50-100g mL） ； 超 净 工 作 台 恒 温 培 养 箱 制 冰 机 高 速 冷 冻 离 心 机 和 超 速 离 心 机 等 四 、 实 验 操 作n 1、 从 新 活 化 的 E.coli DH5平 板 上 挑 取 一 单 菌 落 ， 接 种 于 35ml LB液 体 培 养 中 ， 37 振 荡 培 养 至 对 数 生 长 期 (12h左 右 )；n 2、 将 该 菌 悬 液 以 1:100 1:50转 接 于 100ml LB液 体 培 养 基 中 ，37 振 荡 扩 大 培 养 ， 当 培 养 液 开 始 出 现 混 浊 后 ， 每 隔 2030min测 一 次 OD600， 至 OD600为 0.3 0.5时 停 止 培 养 ， 并转 装 到 1.5 mL离 心 管 中 ； n 3、 培 养 物 于 冰 上 放 置 20min；n 4、 0 4 ， 4000g离 心 10min， 弃 去 上 清 液 ， 加 入 1 mL冰冷 的 0.1mo1 L CaCl2溶 液 ， 小 心 悬 浮 细 胞 , 冰 浴 20分 钟 ； 四 、 实 验 操 作n 5、 0 4 ， 4000g离 心 10min， 倒 净 上 清 培 养 液 ， 再 用 1.0 mL冰 冷 的 0.1mo1 L CaCl2溶 液 轻 轻 悬 浮 细 胞 ， 冰 浴 20min；n 6、 0 4 ， 4000g离 心 10min， 弃 去 上 清 液 ， 加 入 100 L冰 冷 的 0.1mo1 L CaCl2溶 液 ， 小 心 悬 浮 细 胞 ， 冰 上 放 置片 刻 后 ， 即 制 成 了 感 受 态 细 胞 悬 液 ；n 7、 制 备 好 的 感 受 态 细 胞 悬 液 可 直 接 用 于 转 化 实 验 ， 如 果 在 4放 置 12 24h， 其 转 化 效 率 可 以 增 高 4 6倍 ； 也 可 加 入 占 总 体积 15 左 右 高 压 灭 菌 过 的 甘 油 ， 混 匀 后 分 装 于 1.5ml离 心 管 中 ，置 于 -70 条 件 下 ， 可 保 存 半 年 至 一 年 。 五 、 思 考 题n 制 备 感 受 态 细 胞 时 ， 应 特 别 注 意 哪 些 环 节 ？