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目标导航预习导引 目标导航预习导引一二三四一、PCR原理1.概念:是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。2.DNA复制需要的条件解旋酶、DNA母链、4种脱氧核苷酸、DNA聚合酶和引物。3.DNA的热变性:在 80100 的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性;当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链,这个过程称为复性。 4.PCR反应的条件一定的缓冲溶液;DNA模板;分别与两条模板链相结合的两种引物;四种脱氧核苷酸;耐热的DNA聚合酶,一般用Taq DNA聚合酶;控制温度。 目标导航预习导引一二三四二、PCR反应过程1.变性:当温度上升到 90 以上时,双链DNA解聚为单链,一般实验温度为95 。 2.复性:温度下降到50 左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,一般实验温度为 55 。 3.延伸:温度上升到 72 左右,溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 PCR的变性过程实质上也是解旋,PCR的解旋和细胞内的DNA解旋有何不同?提示：PCR在高温条件下(90100 )解旋,而细胞内的DNA在解 旋酶的作用下解旋。 目标导航预习导引一二三四三、实验操作1.PCR仪:能够自动调控温度的仪器,实现DNA的扩增。如果没有PCR仪,可用3个恒温水浴锅代替,操作时在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。2.微量离心管:一种薄壁塑料管,总容积为0.5 mL。 3.微量移液器:用于添加转移PCR配方中的液体。 目标导航预习导引一二三四四、操作提示1.为避免外源DNA等因素的污染,实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。2.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 储存。 3.微量移液器的枪头在吸取试剂后必须更换。DNA很容易吸附在玻璃的表面,而不容易吸附在塑料的表面,由此推测PCR用到的微量离心管是用何种材质加工制作的?提示：是用塑料加工制作的。 知识精要典题例解迁移应用一二知识架构一、PCR的原理及反应过程1.PCR原理(1)概念多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。(2)PCR原理DNA变性:在80100 的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。DNA复性:当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链,这个过程称为复性。DNA合成:DNA聚合酶从引物3端开始延伸DNA链,DNA合成 方向总是从子链的5端向3端延伸。 知识精要典题例解迁移应用一二知识架构(3)条件模板:两条DNA母链。引物:能分别与两条模板链结合的两种引物。原料:四种脱氧核苷酸。酶:耐热的DNA聚合酶。其他条件:稳定的缓冲溶液和能自动调节温度的条件等。 知识精要典题例解迁移应用一二知识架构2.PCR的反应过程(1)PCR过程变性当温度上升到90 以上时,双链DNA解聚为单链。复性温度下降到50 左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 知识精要典题例解迁移应用一二知识架构延伸温度上升到72 左右,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。(2)结果PCR一般要经历30多次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。两引物间固定长度的DNA序列呈指数扩增(即2 n)。 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构【例1】 在实验室内模拟生物体内的DNA复制,需要哪些条件?()酶游离的脱氧核苷酸ATPDNA分子引物tRNA适宜的温度适宜的酸碱度A.B.C.D.解析：在实验室内模拟DNA复制时,需要DNA聚合酶催化合成DNA子链;四种脱氧核苷酸为合成子链的原料;DNA母链为DNA复制的模板;还需要引物、适宜的温度、适宜的酸碱度等。答案：D 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构下列有关PCR的描述,不正确的是()A.是一种酶促反应B.引物决定扩增的特异性C.扩增的对象是氨基酸序列D.扩增的对象是DNA序列解析：PCR是特异扩增两个引物间的脱氧核苷酸序列,而不是氨基酸序列。答案：C 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构细胞内DNA复制与PCR扩增技术的比较 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构注:解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开,而DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯键的。 知识架构一二知识精要典题例解迁移应用二、PCR实验操作和结果分析评价1.PCR体外扩增DNA片段的实验流程 知识架构一二知识精要典题例解迁移应用 知识架构一二知识精要典题例解迁移应用2.实验中DNA含量的测定DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定,具体方法如下:(1)稀释:2 L PCR反应液,加入98 L蒸馏水,即将样品进行50倍稀释(2)对照调零:以蒸馏水作为空白对照,在波长260 nm 处,将紫外分光光度计的读数调节至零(3)测定:取DNA稀释液100 L至比色杯中,测定260 nm处的光吸 收值 知识架构一二知识精要典题例解迁移应用(4)计算:DNA含量(g/mL)=50(260 nm的读数)稀释倍数 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构【例2】 下列有关PCR操作过程的叙述,错误的是 ()A.PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B.PCR缓冲液和酶应分装成小份,在-20 储存C.PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的吸液枪头都必须更换解析：为了防止外源DNA的污染,PCR反应中所用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水等,在使用前要进行高压灭菌;还要将所用的缓冲液和酶分装成小份;并且使用一次性吸液枪头,A、B、D三项都正确。在使用前,将PCR所需试剂从冰箱内拿出来,放在冰块上缓慢融化,C项错误。 答案：C 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构下图表示PCR扩增的产物,请分析它是哪次循环的产物?()A.第一次循环B.第二次循环C.第三次循环D.第四次循环解析：在PCR反应中,以引物为标记,第一次循环时,以加入的DNA为模板,两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸,所以形成的每个子DNA中只有一种引物;从第二次循环开始,上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应,所以会形成DNA分子两端均含有引物的情况。因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。 答案：A 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构几种PCR方法有反转录PCR、扩增未知序列的PCR、致突变PCR、定量PCR、免疫PCR等方法,PCR还可与其他方法联合使用,有很多新的联合法。(1)反转录PCR反转录PCR就是把RNA提取后反转录成互补DNA,并以此互补DNA链为模板进行的PCR反应。通常用于检测某种RNA是否被表达,或者比较其相对表达水平。 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构(2)实时荧光定量PCR所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号的实时检测,从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR的进行,PCR产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。(3)免疫PCR免疫PCR是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。 一二知识架构 误以为PCR过程中DNA聚合酶能对最初的DNA模板进行完整的复制。PCR过程中,第一次循环时,只能从引物结合的部位开始。由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合进行DNA的延伸,由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合进行DNA的延伸,之后,DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。 【例题】 在进行DNA亲子鉴定时,需大量的DNA。PCR技术(多聚酶链式反应)可以使样品DNA扩增,获得大量DNA克隆分子。该技术的原理是利用DNA的半保留复制,在试管中进行DNA的人工复制(如下图,图中短粗线是引物)。在很短的时间内将DNA扩增上百万倍,使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。 (导学号52260016)(1)图中的变性、延伸分别是指、。 (2)假设PCR反应中的DNA模板为P,第一轮循环的产物2个子代DNA为N1,第二轮的产物4个子代DNA为N2,N1、N2中分别含有模板DNA单链的DNA分别有个、个。若继续循环,该DNA片段共经过30次循环后能形成个DNA片段。 (3)某样品的一个DNA分子中共含3 000个碱基对,碱基数量满足:(A+T)/(G+C)=1/2,若经5次循环,至少需要向试管中加入个腺嘌呤脱氧核苷酸(不考虑引物所对应的片段)。 (4)若下图为第一轮循环产生的产物,请绘出以a链和b链为模板经PCR扩增的产物。 解析：(1)变性的实质是DNA双链解旋;延伸的实质是以DNA单链为模板,按碱基互补配对原则合成子链的过程。(2)由于PCR原理为DNA双链复制,其特点是半保留复制,所以无论复制几次,模板链一直存在于2个DNA分子中。DNA复制的数量变化是指数式增长方式。(3)由(A+T)/(G+C)=1/2可知A T G C=1 1 2 2,所以A的比例为1/6,在该DNA分子中的数量为3 0002(1/6)=1 000个,5次循环形成的DNA数为32个,所以由原料合成的DNA数相当于32-1=31个,至少需腺嘌呤脱氧核苷酸为311 000=31 000个。(4)画图的关键是注意引物A、B的位置和所对应的模板链。 答案：(1)模板DNA双链解旋形成单链在DNA聚合酶的作用下,原料脱氧核苷酸聚合形成新的DNA链(2)22230(3)31 000(4)如图
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