文库的构建小结

基 因 文 库 （ Gene library） ： 由 大 量 的 含 有 基 因 组DNA（ 即 某 一 生 物 的 全 部 DNA序 列 ） 的 不 同DNA片 段 的 克 隆 所 构 成 的 群 体 , 称 之 为 基 因 文库 。 一 个 完 全 的 基 因 文 库 ， 应 该 能 够 保 证 从 中筛 选 到 目 的 基 因 。 即 Genomic library第 五 章 DNA文 库 的 构 建 DNA libraries 1976年 L.Clark J.Carbon提 出 了 一 个 完 全 的 基 因 文库 所 需 克 隆 的 计 算 公 式 n=ln(1-p)/ln(1-f)n: 一 个 完 全 基 因 文 库 所 应 包 含 的 重 组 体 克 隆 数p: 所 期 望 的 目 的 基 因 在 基 因 文 库 中 出 现 的 几 率f: 插 入 片 段 的 平 均 大 小 与 基 因 组 DNA大 小 的 比 值 cDNA文 库 :若 这 些 大 量 的 重 组 DNA分 子 所 含 的 外 源DNA不 是 基 因 组 DNA， 而 是 由 某 一 生 物 的特 定 器 官 或 特 定 发 育 时 期 细 胞 内 的 mRNA经反 转 录 形 成 的 cDNA， 它 们 所 构 成 的 重 组DNA克 隆 群 体 ， 则 称 之 为 cDNA基 因 文 库 一 、 cDNA克 隆 用 的 mRNA1. mRNA的 完 整 性第 二 节 cDNA文 库 的 构 建基 因 特 异 性器 官 特 异 性不 均 匀 性mRNA的 大 小 500bp 8kb 大 部 分 1.5 2kb 2 mRNA的 丰 度常 来 自 结 构 基 因 ， 因 此 仅 代 表 某 种 生 物 的 一 小 部 分遗 传 信 息 ， 且 只 代 表 那 些 正 在 表 达 的 基 因 的 遗 传 信息 ： 15% mRNA， 8085% rRNA， 1015% tRNA 高 丰 度 mRNA 珠 蛋 白 ， 免 疫 球 蛋 白 ， 卵 清 蛋 白 在 特 定 细 胞 中 占 50-90%低 丰 度 mRNA0.5% 被 称 为 低 丰 度 或 稀 有 mRNA文 库 应 足 够 大 ， 鉴 定 和 分 离 困 难 反 转 录 酶 AMV (42 ) M-MuLV (37 ) RNase H RNase H弱 长 mRNA 引 物 oligo(dT) 12-18 一 般 要 求 浓 度 高 模 板 氢 氧 化 甲 基 汞 预 处 理 ， 减 弱 链 内 二 级 结 构 RNase 抑 制 剂 AAAAAAAmRNA5 3TTTTTTTT二 、 cDNA第 一 链 的 合 成cDNA 1 自 身 引 导 法三 、 cDNA第 二 链 的 合 成 NaOH处 理 需 用 S1酶 2. 置 换 合 成 法RNaseH, Coli. DNA poly.1, lingase 有 效 无 须 进 一 步 纯 化 不 需 用 S1酶 ， 否 则 会 导 致 cDNA酶 的 大 量 损 失问 题 ： 如 何 脱 帽 以 便 进 入 载 体 5端 cDNA不 能 合 成 （ 少 几 个 Nt） 有 可 能 仍 形 成 发 夹 结 构 3. 第 二 链 引 导 合 成 Okayama-Berg方 法 4. 引 物 -衔 接 头 合 成 法 四 、 ds cDNA的 分 子 克 隆1.同 聚 物 加 尾 问 题 ： 只 对 质 粒 有 效 ， 文 库不 易 保 存 和 复 制 。 尾 的 长 短 不 一 (100dA/dT, 20dG/dC) 同 聚 尾 结 合 的 质 粒 ：cDNA杂 合 分 子 转 化E.coli的 效 率 随 宿 主 不同 而 不 同 。 2 合 成 接 头 和 衔 接 头cDNA 合 成 接 头(含 酶 切 位 点 )酶 切 NotI, SalI与 载 体 连 接Optional: methylation 接 头 中 含 稀 有 位点 ， 如 NotI, SalI(100kb一 次 ) 先 甲 基 化 ds cDNA，再 连 接 接 头 用 衔 接 头 替 换 接 头 接 头 中 含 稀 有 位 点 ， 如 NotI, SalI(100kb一 次 ) 先 甲 基 化 ds cDNA， 再 连 接 接 头 用 衔 接 头 替 换 接 头3. 其 他 方 法 mRNA-cDNA杂 交 体 克 隆 依 次 连 加 不 同 接 头 其 他 与 cDNA第 二 链 合 成 有 关 的 方 法 ， 如 Okayama-Berg方 法 和 引 物 -衔 接 头 合 成 法 3. 其 他 方 法(1) mRNA-cDNA杂 交 体 克 隆mRNAcDNAAAAA AAAARNA 末 端 加 尾 效 率只 及 DNA的 1/10合 成 第 一 链 后 , 加 尾 , 与 带 dT尾 的 载 体 退 火 , 在 宿 主 体 内 , 可除 去 RNA, 代 之 以 DNA优 点 : 无 须 合 成 第 二 链 , 序 列 完 整 但 效 率 1/10 (2) RACE random amplification of cDNA ends cDNA克 隆 是 常 出 现 丢 失 末 端 序 列 的 现 象 ， 需 较长 时 间 获 得 全 长 cDNA克 隆 筛 选 文 库 是 一 般 只 能 针 对 一 个 或 几 个 cDNA克 隆 ， 而 RACE可 产 生 大 量 独 立 克 隆 mRNAcDNA TTTTTTTT-QI-QOAAAAAAA1. 经 典 RACE3末 端 克 隆 TTTTTTTT-QI-QO反 转 录 QOPCR GSP1 QIGSP2根 据 已 经 得 到 的不 完 整 的 cDNA的 序 列 设 计 引 物 GSP1 和 GSP2 PCRcDNA克 隆 中 , 得 到 了 不 完 整 的片 段 , 可 采 用 此 方 法 获 得 3末 端和 5末 端 的 序 列 5末 端 克 隆 mRNA AAAAAAAGSP1GSP1AAAAAQ1-Q2- TTTTTT Q1/ GSP1 PCR反 转 录Q2/ GSP2 PCRGSP2 获 得 的 cDNA 克 隆 片 段 AAAAAAAGSP1 反 转 录连 接 RNA寡 聚 物NNNNNNNN2. 新 RACE 第 三 节 基 因 克 隆 的 策 略基 因 克 隆 的 本 质从 文 库 中 筛 选 目 标 克 隆 ， 重 点 在 “ 筛 选 ”常 见 筛 选 工 具 : 探 针狭 义 : 核 酸 , 抗 体广 义 : 还 包 括 其 他 筛 选 手 段 抗 性 基 因 : antibiotics抗 性 基 因 , 抗 重 金 属 活 性一 、 功 能 筛 选 分 解 基 因 : 苯 环 化 合 物 , 分 解 酶 功 能 活 性 ： 杀 虫 ， 酶 启 动 子 /复 制 子利 用 目 标 基 因 的 特 定 功 能 进 行 筛 选Amp ori MCS Tet gene without promoter 功 能 缺 失在 获 得 相 应 突 变 体 的 前 提 下以 此 突 变 体 作 为 宿 主在 野 生 型 的 DNA导 入 后 检 测 回 复 突 变如 营 养 缺 陷 型 相 关 的 基 因二 、 核 酸 探 针 同 源 DNA探 针 高 度 保 守 的 基 因 rRNA基 因邻 近 种 属 的 相 应 基 因相 应 基 因 的 序 列 比 较 合 成 寡 核 苷 酸蛋 白 质 N-末 端 aa序 列 简 并 探 针 degeneracy选 取 简 并 程 度 低 的 aa序 列 综 合 合 成可 能 的 话 设 计 一 对 , 用 PCR产 物 作 探 针 根 据 密 码 子 的 使 用 频 率 , 合 成 猜 测 体 探 针 设 计 两 组 简 并 探 针 , 用 第 二 个 探 针 对 第 一 次 筛选 的 阳 性 克 隆 子 作 第 二 次 杂 交 三 、 免 疫在 可 获 得 PT后 , 制 备 抗 体 , 用 于 筛 选 六 、 mRNA差 别 显 示 PRIMER R 12 5 GATCTGCGGTGA 3 3 CTAGACGCCACT 5 R 24 5 TGCGGTGAGAGGCTGGAGAGTGCT 3 3 ACGCCACTCTCCGACCTCTCACGA 5 J 12 5 GATCTGTTCATG 3 J 24 5 TGTTCATGGATAGTCGACGTCGGT 3 N 12 5 GATCTTCCCTCG 3 N 24 5 TTCCCTCGGATAGCACAGTTGCCT 3 DpnII 酶 切 双 链 cDNA产 生 粘 性 末 端 , 每 对 引 物 之 间 退 火 后 两 两互 补 可 形 成 DpnII的 酶 切 位 点 ， 3对 接 头 (引 物 ) 中 , 1对 制 备 扩 增 子 ,另 外 2对 用 于 杂 交 和 扩 增 的过 程 中 。 R 12 5 G ATCTG CG G TG A 3 3 CTAG ACG CCACT 5 R 24 5 TG CG G TG AG AG G CTG G AG AG TG CT 3 3 ACG CCACTCTCCG ACCTCTCACG A 55 G ATCTG CG G TG A 3 ACG CCACTCTCCG ACCTCTCACG A5 TG CG G TG AG AG G CTG G AG AG TG CT 3 CTAG ACG CCACT3 AG CACTCTCCAG CCTCTCACCG CA 5 AG TG G CG TCTAG 5 G ATCTG CG G TG A 3 ACG CCACTCTCCG ACCTCTCACG A5 G ATC CTAG3 AG CACTCTCCAG CCTCTCACCG CA 5 AG TG G CG TCTAG 合 成 driver and tester cDNA Dpn II酶 切 两 组 双 链 cDNA R24、 R12 及 DNA 连 接 酶 连 接 Dpn II酶 切 的 cDNA 以 R24 为 引 物 分 别 PCR扩 增处 理 组 和 对 照 组 用 Dpn II 充 分 酶 切 , 切 掉R24的 接 头 , 即 得 到 扩 增 子作 为 driver 更 换 接 头 , 连 接 J24、 J12 到扩 增 子 , 建 立 1个 试 验 者 群体 。 Tester以 1 100 分 子 比 例 与driver 混 合 , 在 95 96 变性 , 67 杂 交 , 在 两 cDNA 群体 间 成 对 比 较 用 J24引 物 PCR扩 增 , T:D 呈线 性 递 增 , 产 物 单 链 DNA , T:T 杂 交 体 呈 指 数 递 增 , 且为 dsDNA 分 子 , D:D 杂 交 不能 进 行 PCR 扩 增 第 六 章 重 组 DNA导 入 宿 主转 化 转 导 转 染 感 染 结 合 其 它 一 、 转 化 transformation 一 种 遗 传 转 移 方 式 1928年 Griffith 首 次 发 现肺 炎 双 球 菌 （ Diplococcus pneumoniae）少 量 无 毒 RII（ 无 荚 膜 ， 粗 糙 ） 大 量 杀 死 有 毒 SIII（ 有 荚 膜 ， 光 滑 ） 混 合 注 射 小 白 鼠鼠 死 可 分 离 出 活 SIII细 胞RII细 胞 + SIII DNA 即 一 来 自 一 个 细 菌 细 胞 (供 体 )的 DNA(片 段 )被另 一 个 细 胞 (受 体 )所 吸 收 (随 后 同 受 体 染 色 体 一起 进 行 重 组 )对 DNA的 吸 收 ， 仅 在 受 体 生 长 周 期 中 的 一 个 短 暂阶 段 。 能 够 吸 收 DNA的 细 胞 ， 称 作 感 受 态 细 胞(competent cell) 在 转 化 中 有 功 能 的 DNA是 双 链 或 ssDNA， 线 状 或 环 状（ 一 ） CaCl2转 化 法 核 心 ， 目 标 细 胞 在 CaCl2H2O溶 液 中 浸 泡 一 段 时 间 E.coli： 100mME.coli: DH5, TG1, XL-1Blue, JM105 冰 上 30min 热 激 42 90恢 复 1 2min复 苏 37 45-60 min转 化 效 率 107-109 cell/gDNA转 化 子 （ transformant）转 化 后 的 受 体 菌 ， 称 转 化 子 （ 二 ） 原 生 质 体 转 化 法 protoplastG+细 菌 ， 特 别 是 芽 胞 杆 菌 ， 酶 母Lysozyme / 等 渗 环 境 下 ， 脱 细 胞 壁细 胞 壁 再 生(三 )电 转 化 法 （ electroporation）10%甘 油 或 蔗 糖 ， 含 (或 不 含 )Mg2+ 离 子2.5 KV/0.4cm 25F 200-400Gene Pulse, Bio-Rad 公 司电 转 杯 由 噬 菌 体 将 细 菌 基 因 由 一 个 细 菌 （ 供 体 ） 转 移 到另 一 个 细 菌 （ 受 体 ） 的 过 程二 、 转 导 （ transduction）（ 一 ） 普 遍 性 转 导 (generatized transduction)phage在 供 体 中 烈 解 中 ， 部 分 供 体 DNA被 包 装 ， 当感 染 受 体 菌 时 ， 若 感 染 变 数 小 于 1时 ， 缺 陷 phage可 将 供 体 DNA注 入 受 体 (此 时 原 phage DNA不 感 染 ) 形 成 新 的 表 型 但 这 种 表 型 不 一 定 稳 定 ， 因 为 供 体 DNA不 一 定 与受 体 发 生 重 组 ， 故 此 类 转 导 称 流 产 转 导 （ abortive transduction） ， 否 则 称 完 全 转 导 (complete transduction)(二 ) 局 限 性 转 导Specialized (or restricted) transduction phage 不 正 确 切 离 时 以 10 -6比 率产 生 dgal （ 半 乳 糖 基 因 ） 或 dbio（ 生 物 素 基 因 ）以 温 和 噬 菌 体 为 媒 介 ， 将 供 体 细 菌 染 色 体 的 特 定 部 分 转移 给 受 体 细 菌 的 过 程 。 噬 菌 体 DNA直 接 参 与 了 转 导 过 程 。 dgal双重溶源菌进入裂解状态可产生两种噬菌体 感 受 态 细 胞 经 分 离 出 来 的 噬 菌 体 核 酸 所 感 染 ，随 后 能 产 生 出 正 常 噬 菌 体 后 代 ， 叫 转 染三 、 转 染 (transfection)这 一 过 程 与 转 化 是 相 同 的 ，区 别 ： 使 用 的 质 粒 载 体 换 成 了 噬 菌 体 。转 染 ；体 外 包 装 A. 缺 陷 性 噬 菌 体 B.两 个 缺 陷 性 噬 菌 体 株 两 个 缺 陷 性 噬 菌 体 株两 个 噬 菌 体 株 都 在 编 码 噬 菌 体 蛋 白 外 壳 的某 一 组 分 基 因 带 有 一 个 突 变 位 点 ： 一 个 突 变 发 生 在 D基 因 上 ； 另 一 个 突 变 发 生 在 E基 因 上 。 感 染 复 数 （ multiplicity of infection, MOI）指 在 一 定 体 系 中 ， 病 毒 颗 粒 与 敏 感 细 胞 的 比 率四 、 感 染 （ infection）病 原 微 生 物 在 寄 主 组 织 内 立 足 的 状 态如 细 菌 的 感 染 ， Virus/ phage的 感 染phage包 装 ， cosmid感 染概 念 交 叉转 染 ： 病 毒 核 酸 的 转 移转 化 ： 普 通 DNA的 转 移 感 染 ： 病 毒 的 侵 染转 导 ： 强 调 转 移 方 式