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目标导航预习导引 目标导航预习导引一二一、分离蛋白质的原理与方法1.分离蛋白质的原理2.分离蛋白质的方法(1)凝胶色谱法概念:根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法,也叫分配色谱法。 目标导航预习导引一二过程及原理b.分离的过程 目标导航预习导引一二c.分离原理:依据相对分子质量的不同而将蛋白质分离。(2)电泳法电泳的概念:指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。原理:利用了待分离样品中各种分子的带电性质的差异、分子本身的大小以及形状的不同,使带电分子在电场中产生不同的迁移速度,从而分离样品中的各种分子。分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中后者使用时通常加入带负电荷多的SDS,形成“蛋白质-SDS复合物”,使蛋白质迁移速率仅取决于分子的大小。3.缓冲溶液(1)组成:通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例,可配制不同pH的缓冲液。 (2)作用:抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变。 目标导航预习导引一二缓冲溶液中含对酸碱起缓冲作用的缓冲对,每一缓冲对均由弱酸和相应的强碱盐组成。细胞外液也有酸碱缓冲对,你能回忆并说出细胞外液中的酸碱缓冲对吗?提示：细胞外液中主要的酸碱缓冲对有:H 2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等。 目标导航预习导引一二二、凝胶色谱法的实验操作1.蛋白质的提取和分离步骤(1)样品处理血红蛋白的释放:红细胞在蒸馏水和甲苯作用下破裂,释放出血红蛋白分离血红蛋白溶液:混合液离心过滤去除脂溶性沉淀层用分 液漏斗分离 目标导航预习导引一二(3)纯化:凝胶色谱法。(4)纯度鉴定:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 目标导航预习导引一二2.凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作。(2)凝胶色谱柱的装填。固定:将色谱柱垂直固定在支架上装填:将用蒸馏水充分溶胀后的凝胶配成凝胶悬浮液,一次性缓慢倒入色谱柱内,装填时可轻轻敲动色谱柱,使凝胶装填均匀洗脱:装填完后,立即用缓冲液洗脱瓶,在约50 cm高的操作压下,用300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L 的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分洗涤平衡凝胶12 h 目标导航预习导引一二(3)样品的加入与洗脱。加样前:打开下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口。加透析样品。调整缓冲液面:与凝胶面平齐滴加透析样品:用吸管将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端样品渗入凝胶床:加样后,打开下端出口,等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口 洗脱:打开下端出口,用 20 mmol/L的磷酸缓冲液洗脱 目标导航预习导引一二收集:待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每5 mL收集一管,连续收集 3.操作提示(1)红细胞的洗涤:洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀,达不到分离效果。(2)色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀,可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热,加速膨胀。(3)凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。(4)蛋白质的分离:如果红色区带均匀一致地移动,说明色谱柱制 作成功。 目标导航预习导引一二(1)凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱都装填有不能通过“柱”下端多孔板(或多孔筛板)的颗粒,它们的颗粒功能有何不同?提示：凝胶色谱柱装填的是凝胶颗粒,允许小分子进入,不允许大分子进入,通过延长小分子的路程使大分子与小分子分离。固定化酶的反应柱装填的是固定有酶的载体颗粒,既能催化反应物的反应,又保证了酶与反应物分子的分离,实现了酶的重复利用,节约了生产成本。(2)凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱都能进行化学反应吗?提示：不是。固定化酶的反应柱能进行化学反应,凝胶色谱柱不能进行化学反应。 知识精要典题例解迁移应用知识架构一二一、血红蛋白提取和分离的原理1.分离不同种类蛋白质的原理蛋白质的理化性质(如形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等)千差万别,由此可提取和分离各种蛋白质。2.凝胶色谱法(分配色谱法)(1)凝胶:实际上是一些微小的多孔球体,大多数是由多糖类化合物构成的,如葡聚糖、琼脂糖。(2)原理:凝胶小球体内部有许多贯穿的通道,相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,只能分布在颗粒之间,通过的路程较短,移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道,通过的路程较长,移动速度较慢,因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分子分离。 知识精要典题例解迁移应用知识架构一二(3)分离过程:混合物上柱洗脱大分子蛋白质流动快、小分子蛋白质流动慢收集大分子收集小分子。3.缓冲溶液(1)原理:由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成(如H2CO3/NaHCO3,NaH2PO4/Na2HPO4等),调节酸和盐的用量,可配制不同pH的缓冲液。(2)缓冲液作用:抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰,从而保持pH稳定。 知识精要典题例解迁移应用知识架构一二4.凝胶电泳法(1)原理:许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。(2)常见分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构【例1】 用凝胶色谱法分离蛋白质的实验中,相对分子质量不同的两种蛋白质在凝胶中的行进过程,可表示为图中哪一个()解析：凝胶色谱法是依据蛋白质相对分子质量的大小不同而将其分离的。相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道,路程短,移动快,洗脱出来所用的时间短;相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道,路程长,移动慢,洗脱出来所用的时间长。答案：B 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构分离蛋白质不必考虑的因素是()A.分子的形状和大小 B.蛋白质所带电荷的性质和多少C.蛋白质的溶解度D.蛋白质肽键的结构解析：所有蛋白质的肽键结构相同,均为“NHCO”,不作为分离蛋白质考虑的因素。答案：D 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构电泳方法 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构二、凝胶色谱法的操作流程 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构【例2】 下列关于红细胞的洗涤过程的叙述,正确的是()A.低速长时间离心,如500 r/min,12 min,以保证达到很好的分离效果B.离心后用胶头吸管吸出下层透明的红色血浆C.将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯,再加入五倍体积的蒸馏水D.直至上清液中没有黄色,表明红细胞已洗涤干净解析：红细胞洗涤过程中,应做低速短时间离心,以避免白细胞、淋巴细胞等一同沉淀,影响血红蛋白的提纯;离心后血浆在上层,并呈现为黄色,需用胶头吸管吸出;洗涤红细胞时应用生理盐水而不用蒸馏水,否则,将导致红细胞破裂影响实验结果。因此A、B、C均错误。 答案：D 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构利用凝胶色谱法分离蛋白质时,蛋白质洗脱出来的顺序是()相对分子质量最大的相对分子质量最小的相对分子质量适中的A.B.C.D.解析：相对分子质量较大的蛋白质容易通过凝胶间隙,先被洗脱出来;相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部,后被洗脱出来;相对分子质量适中的,能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分,洗脱出来的时间也居中。答案：C 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构1.样品处理、分离与纯化的目的不同 一二知识精要典题例解迁移应用知识架构2.分离血红蛋白溶液的结果 知识架构一二 在装填凝胶色谱柱时,要注意凝胶装填的要紧密、均匀。因为如果装填的不够紧密、均匀,就会在凝胶色谱柱内形成无效的空隙,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液的流动次序,影响分离效果。同时在凝胶色谱操作中,不能发生洗脱液流干,漏出凝胶颗粒的现象。一旦发生以上现象,凝胶色谱柱必须重新装填。【例题】 随着人类基因组计划的进展和多种生物基因组测序工作的完成,人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用,首先要获得纯度较高的蛋白质。 (导学号52260017) .血红蛋白提取的具体过程可分为:(1)红细胞的洗涤。具体操作过程是;(2);(3)分离血红蛋白溶液。血红蛋白混合液在离心管中离心后,从上往下数第层是红色透明液体即为血红蛋白的水溶液;(4)透析。.透析后的样品还需经过凝胶色谱法进一步纯化,其目的是,装填凝胶色谱柱时,要注意色谱柱内不能有气泡,这是因为。 .判断纯化的蛋白质是否达到要求,可用电泳法对样品进行,电泳是指。 解析：.(1)红细胞的洗涤目的是去除杂蛋白,过程是将采集的血样低速短时间离心,吸出上层透明黄色血浆,再用五倍体积的生理盐水低速短时间离心,重复洗涤三次。(2)血红蛋白的释放:在蒸馏水和甲苯作用下,红细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液:试管中的溶液分为4层。第1层为无色透明的甲苯层,第2层为白色薄层固体,是脂溶性物质的沉淀层,第3层是红色透明液体,这是血红蛋白的水溶液,第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。血红蛋白混合液在离心管中离心后,从上往下数第3层是红色透明液体即为血红蛋白的水溶液。(4)透析:可以去除样品中相对分子质量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。.透析后的样品还需经过凝胶色谱法进一步纯化,其目的是去除相对分子质量较大的杂质蛋白。装填凝胶色谱柱时,要注意色谱柱内不能有气泡,这是因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。.判断纯化的蛋白质是否达到要求,可用电泳法对样品进行纯度鉴定,电泳是指 带电离子在电场的作用下发生迁移的过程。 答案：.(1)将采集的血样低速短时间离心,吸出上层透明黄色血浆,再用五倍体积的生理盐水低速短时间离心,重复洗涤三次(2)血红蛋白的释放(3)3.去除相对分子质量较大的杂蛋白气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果.纯度鉴定带电离子在电场的作用下发生迁移的过程
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