韩飞开题报告

大连大学本科毕业论文（设计）开题报告论文题目：紫外诱变筛选营养缺陷型工业酵母学院：生命科学与技术学院专业、班级：生物技术10级1班学生姓名：韩飞指导教师（职称）：李倩（讲师）2014 年 03 月 10 日填毕业论文（设计）开题报告要求开题报告既是规范本科生毕业论文工作的重要环节，又是完成高质量毕业论文（设 计）的有效保证。为了使这项工作规范化和制度化，特制定本要求。一、选题依据1. 论文（设计）题目及研究领域；2. 论文（设计）工作的理论意义和应用价值；3. 目前研究的概况和发展趋势。二、论文（设计）研究的内容1. 重点解决的问题；2. 拟开展研究的几个主要方面（论文写作大纲或设计思路）；3. 本论文（设计）预期取得的成果。三、论文（设计）工作安排1. 拟采用的主要研究方法（技术路线或设计参数）；2. 论文（设计）进度计划。四、文献查阅及文献综述 学生应根据所在学院及指导教师的要求阅读一定量的文献资料，并在此基础上通过 分析、研究、综合，形成文献综述。必要时应在调研、实验或实习的基础上递交相关的 报告。综述或报告作为开题报告的一部分附在后面，要求思路清晰，文理通顺，较全面 地反映出本课题的研究背景或前期工作基础。五、其他要求1. 开题报告应在毕业论文（设计）工作开始后的前四周内完成；2. 开题报告必须经学院教学指导委员会审查通过；3. 开题报告不合格或没有做开题报告的学生，须重做或补做合格后，方能继续论文 （设计）工作，否则不允许参加答辩；4. 开题报告通过后，原则上不允许更换论文题目或指导教师；5. 开题报告的内容，要求打印并装订成册（部分专业可根据需要手写在统一纸张上 但封面需按统一格式打印）。一、选题依据1. 论文（设计）题目紫外诱变筛选营养缺陷型工业酵母2. 研究领域微生物3论文（设计）工作的理论意义和应用价值微生物营养缺陷型是工业生产和科学研究的珍贵材料。获得营养缺陷型酵母菌的 方法很多，但这方面的研究结果多采用实验室单倍体菌株对二倍体产生的子囊抱子进 行突变获得，工业酵母的营养缺陷型研究报道很少。而目前又迫切需要一种好的在工 业酵母中引入选择性标记的方法。酵母絮凝特性是工业生产中重要性状，可以提高细 胞密度，增加发酵效率，且大大简化后处理工艺，降低分离成本。为进一步改良絮凝 酵母的发酵特性，需对其进行遗传操作，因此本实验获得絮凝酵母营养缺陷型突变体 具有重要意义。4. 目前研究的概况和发展趋势工业微生物的育种是现代工业发展的一个关键环节，现代生物技术特别是发酵工 程技术的最终产品，对工业微生物菌种的优化选育是提高产量和质量的一条有效途 径。国内微生物诱变育种具有速度快、收效大、方法简单等优点。它是菌种选育 的一个重要途径，迄今为止，国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是人工诱 变选育出来的。诱变育种尤其是物理诱变育种技术已成为目前工业微生物育种中最为 常用和最有的技术之一2。物理诱变是使用辐射中的各种射线为诱变源（包括紫外线、X射线、y射线、快 中子、微波、超声波、电磁波、激光和宇宙射线等），对生物靶进行诱变。多年的育 种实践发现，对微生物诱变效果较好且应用较广泛的主要有紫外线、X射线、y射线 和快中子。其中紫外诱变法具有操作方便安全、无化学诱变剂的毒性且效果明显，可 以细胞全局水平引入突变，该技术在研究中已经具有很成熟的基础2 。李凤林等对 产曲酸的米曲霉菌株进行紫外线诱变选育；李亚蕾等对抗噬菌体保加利亚乳杆菌进行 紫外线诱变选育；刁小琴等对浓香型枸杞酒酿造酵母进行紫外线诱变选育均取得了较 理想的成果。同时，很多研究者将紫外诱变结合其他诱变方式配合使用，更是产生了 突出的效果。赵铭钦等将紫外线与硫酸二乙酯结合使用进行复合诱变，筛选到了巨大 芽抱杆菌突变株B8，其a-淀粉酶和蛋白酶活性较出发菌株分别提高 96.41%和 126.58%，突变株经5次传代后,性能保持稳定。卢燕云等通过紫外线-氯化锂-硫酸二 乙脂复合诱变，筛选出酸性蛋白酶高产突变株，其酶活力比出发菌提高了 129.3% 5。 利用这些诱变源进行单一或复合诱变虽然得到了大量的高产工业微生物菌株。但是， 长期、重复使用某种诱变源,，往往导致突变率低、突变谱窄和抗性饱和。因此，一些 新型、高效的诱变方法应运而生。如空间诱变、离子注入诱变、激光诱变等新型、高 效的微生物诱变育种技术。近些年，随着人们对育种技术的不断探索和追求，有许多 新的育种技术相继应用于实践、微波、双向复合磁场、红外射线和高能电子流等新诱 变技术相继应用于微生物育种中6。营养缺陷型菌株在工业微生物育种学、遗传学医学和食品生物技术等领域都有非 常重要的作用。科研工作者常常需要各种营养缺陷型突变株，以便用于科学研究和实 际生产。1953年，Adelberg首次利用青霉素固体平板法筛选出了氨基酸缺陷型菌株随 后Luig i又对这种方法进行了改进，使其应用性得到了增强。营养缺陷型微生物细胞在发酵工程上也有很重要的意义，其在生产上可作为氨基 酸、核昔酸、抗生素和蛋白质等的生产菌，理论上可进行基质代谢途径分析，并可作 为遗传标记应用于遗传工程和菌种改良的研究中。营养缺陷型为初级代谢途径阻断变 异型，因此其也经常作为初级代谢途径研究的可靠遗传标记经常作为初级代谢途径 研究的可靠遗传标记7 8。目前，在营养缺陷型突变株的筛选过程中，一般都是凭借 经验确定一些关键参数，尚无确定的定量化方法。在发酵工业中，絮凝是酵母菌株最重要性质之一絮凝是酵母很重要的特性之一， 在工业发酵中，通常希望在发酵结束时，分散于发酵液中的细胞相互凝聚形成絮凝颗粒 沉积，从而有利于细胞同发酵液的有效分离，可以大大简化后处理工艺，降低成本9。 如何控制絮凝基因只在发酵结束时表达，而不在发酵的早期及中期表达，这一问题已 引起相关学者和发酵行业的重视】。尿嘧啶营养缺陷型的菌体缺失了尿嘧啶核苷酸 合成途径中的乳清核苷酸转移(OPRT)或乳清苷单磷酸脱羧酶(ODC)，因此常用5-F0A 来筛选尿嘧啶缺陷型的突变株。随着对酵母新絮凝遗传调控及外界环境影响因素更深 入的研究，絮凝独特性质的生理现象必将显示出其巨大的应用价值，具有重要的理论 意义和广泛的应用前景。二、论文（设计）研究的内容1. 重点解决的问题1.1确定紫外照射时间和最适致死率关系，获得突变体；1.2稳定遗传的营养缺陷型突变株的突变类型确定。2. 拟开展研究的几个主要方面（论文写作大纲或设计思路）2.1建立针对絮凝酵母的筛选体系；2.2筛选絮凝酵母营养缺陷型突变体；2.3进行营养缺陷型类型的鉴定。3. 本论文（设计）预期取得的成果获得絮凝酵母的营养缺陷型突变体三、论文（设计）工作安排1拟采用的主要研究方法（技术路线或设计参数）；1.1建立自絮凝酵母的解絮方法，确立针对絮凝酵母的紫外诱变流程；1.2建立紫外照射致死曲线选择择合适的照射时间，采用制霉菌素富集的方法获 得所需要的突变体，用5-F0A方法筛选尿嘧啶缺陷型菌株；1.3采用互补实验验证获得的突变体类型。2.论文（设计）进度计划2013.03.012013.03.10 :搜集相关资料。2013.03.112013.03.17：分析材料并进行技术路线实验设计。2013.03.182012.03.23:实验材料准备，紫外梯度照射获得照射致死曲线，确定最佳作用时间后富集突变株。2012.03.242012.04.30：通过YPD和SD以及补充培养基验证突变株类型，5-FOA平板上长出的菌株只涂布SD+Ura的补充培养基平板，将突变株传代9次做稳定性实验。2012.05.12012.05.10:营养缺陷型菌株的互补实验，验证本实验得到的菌株具体的突变类型。2012.05.112012.05.15 :数据分析和处理并得出结论，论文的修改与总结。四、需要阅读的参考文献1 张敏,曹燕子，李志斌.燃料乙醇研究概况及发展前景.湖南科技学院学报,2007,28:89-91.2 胡纯铿，白凤武,安利佳絮凝特性对自絮凝颗粒酵母耐酒精能力的影响及作用机制.生物工 程学报,2005.21(1):123128.3 张博润，任健，刘玉方.酵母菌絮凝机理研究进展及应用前景.微生物学通报,1996, 23(5): 307-311.4 刘楠,王冬立，何秀萍等.酵母新絮凝特性的研究进展及应用展望.食品与发酵工 业,2007,33(1):89-91.吕宪峰，毛得奖啤酒酵母絮凝机理研究进展.酿酒科技,2006,4:87-90.6 Peng X, Sun J, Verachtert H, et al. Flocculation and Coflocculation of bacteria bu yeasts. Appl Microbiol Biotechnol,2001,55:777-781.7 郭雪娜，何秀萍，傅秀辉等工业酵母的遗传修饰研究进展及其应用前景.中国生物工程杂 志.2003,23(10): 47-51.8 Burke D, Dawson D,S tearns T. Methods in Yeast Genetics,A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual(影印版).第1版.北京：清华大学出版社,2002, 103105,171181.9 王镜岩，朱圣庚,徐长法生物化学(下册)第3版北京:高等教育出版社,2004,396398,427435.10 栾雨时，包永明.生物工程实验技术手册.第1版.北京：化学工业出版社,2005129132,394395附：文献综述或报告紫外诱变筛选营养缺陷酵母韩飞大连大学生命科学与技术学院 大连 116622摘 要：微生物营养缺陷型郡主在工业生产和科学研究中都有很重要的意义，本文对酵母絮凝特性做了简 要介绍，并阐述了紫外诱变技术及营养缺陷株的相关应用价值。关键词：絮凝;紫外诱变；营养缺陷工业酵母的育种工作一直是工业生物技术研究的热点和重点。研究和应用絮凝技术 已经成为生化领域的重要课题。尽管人们已经提出了各种假说，但至今尚未形成公认的 定论，因此继续从各角度研究微生物的絮凝机理仍将是各国科学工作者研究的热点1。 营养缺陷型菌株在发酵工业生产方面，可以直接用于发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产 物；在科学研究中又是微生物代谢以及接合、转化和转导等实验的重要遗传标记菌株。1. 酵母絮凝作用1.1絮凝的概念酵母絮凝是指酵母细胞之间相互作用形成絮状物的可逆过程2。在发酵工业中，絮 凝是酵母菌株最重要性质之一。1.2絮凝机理酵母的絮凝取决于其细胞壁的性质。酵母絮凝与否，是细胞之间的静电斥力与作用于 相邻细胞间的特殊的键合力相互竞争的结果。在分子水平上研究酵母絮凝机理的不同假 说都认为:酵母的絮凝需要有二价离子的参与，尤其是Ca2 +离子。1.3 影响微生物絮凝的因素这些因素的影响都可最终表达在细胞壁上，再通过细胞壁的组成来影响絮凝; 其中, 环境因素还可以直接影响细胞的絮凝4。简单地说, 影响细胞絮凝的因素可以概括为3 个 方面：基因因素、生理因素及环境因素。对于给定的微生物物种，这3个因素中，环境因 素为人为可控因素。絮凝在生物技术中的应用在生物工业领域中，絮凝技术主要应用于 生化产品的制备和污（废） 水的处理。1.4 絮凝酵母的应用价值絮凝状态的酵母细胞具有抗环境压力能力强、回收利用简单、使用寿命长等多种优 势。在发酵阶段应用絮凝技术主要是利用菌体的自絮凝性能或通过诱导使菌体在一定条 件下发生絮凝，从而提高目标产物的浓度3。在下游处理阶段主要是通过添加絮凝剂使 颗粒细小的胶体、菌体细胞、细胞碎片、残留培养基等固形物结合成较大的颗粒，从而 使发酵液的固液分离更容易实现，极大的降低了固液分离的成本。1.4.1 乙醇发酵的自固定化系统酵母自絮凝会引起细胞形态改变，并可以显著提高其乙醇耐受性。固定化酵母发酵 技术可解决目前国内外乙醇发酵过程中发酵罐中菌体密度低，发酵时间长，后续分离处 理成本高等一系列问题5。方法简单无附加成本，连续使用寿命长，有效地解决了常规 固定化酵母生产的许多问题（ 如载体材料问题、抗杂菌污染问题、使用寿命问题等）。1.4.2 酿造工业在酿造行业中，酵母不絮凝不仅不利于啤酒的澄清，而且由于酵母的自溶还有可能 会破坏啤酒的风味6。因此，酿造行业采用絮凝和非絮凝酵母混合培养以优化啤酒的质 量。1.4.3 微生物絮凝剂的生产微生物絮凝剂是一类由微生物产生的具有絮凝功能的高分子有机物，主要有糖蛋白、 粘多糖、纤维素和核酸等。1.4.4 生物产业废水处理絮凝状态的酵母细胞具有更好的抗环境压力能力，分离回收更加容易，细胞壁可以 提供更多的金属结合位点，其富集重金属能力较非絮凝性酵母更强等诸多优势。2. 紫外诱变技术紫外诱变法具有操作方便安全、无化学诱变剂的毒性且效果明显。用于诱发营养缺 陷型的诱变剂有亚硝基胍，紫外线，亚硝酸等。微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫 外线。 诱变所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀， 这样可以避免出现不纯的菌落。用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细 菌对诱变剂的反应最灵敏。 诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂 量和相对剂量7。相对剂量与三个因素有关，这三个因素是：诱变源和处理微生物的距 离，诱变源（紫外灯）的功率，以及处理的时间。前二个因素是固定的，所以通过处理 时间控制诱变剂量。2.1 紫外线诱变的机理紫外线是波长136390 nm 的电磁波，它是一种非电离辐射。紫外线诱变的最佳波长 范围是200300 nm,其中又以260 nm左右最佳。紫外线之所以能引起杀菌或诱变，主要 是由于遗传物质DNA吸收紫外线而受影响。紫外线被DNA吸收后引起突变的原因，有 的是DNA与蛋白质的交联，有的是胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用，有的是DNA链的 断裂，还有的是形成嘧啶二聚体产生交联作用。阻碍双链的分开，使复制无法进行下去 从而造成DNA异常配对91。2.2 诱变的步骤诱变的整个过程主要包括诱变和筛选两个部分，一般步骤如下。2.2.1 出发菌株的选择根据经验，选择已经经过多次诱变并且每次诱变都有较好效果的菌株作为出发菌株， 可以获得较好的效果8。2.2.2 诱变剂的选择目前在育种实践中应用较多的诱变剂是紫外线、X射线、亚硝酸等。2.2.3 诱变剂量的选择一般来说，随着剂量的增加，诱变率也增加，但超过一定限度，随着剂量的增加， 诱变率反而下降。过去常采用杀菌率为99%或90%的紫外线进行育种，而现在倾向于采用 杀菌率为70%-75%，甚至更低的紫外线育种10。2.2.4 突变体的筛选因为存活下来的突变体的性状并不相同，基因的改变是随机的，非定向的，因而必 须进行多次筛选，才能选出具有优良性状的突变体11。3. 营养缺陷型3.1 营养缺陷型概念及应用营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途 径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、维生素)的能力，必须在基 本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株14。这类菌株可以通过降低 或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分 支合成途径中末端产物积累16。它可作为研究代谢途径和杂交、转化、转导、原生质体 融合、质粒和转座因子等遗传规律所不可缺少的标记菌种；也可作为氨基酸、维生素、 碱基等物质生物测定的实验菌种；在生产中，可直接用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代 谢产物的生产菌株；也可作为菌种杂交、重组育种和利用基因工程进行育种时所不可缺 少的带有特定基因标记的亲本菌株12。3.2 突变菌株的检出与验证在诱变之后存活的菌体中，存活的营养缺陷型菌株的数量很少，而野生型细胞却大 量存在，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型 的目的。营养缺陷型菌株的筛选一般包括诱发突变，淘汰野生型菌株，检出缺陷型，鉴 别缺陷种类等步骤18。检出营养缺陷型也有逐个测定法、影印培养法、夹层培养法和限 量补给法。要设法把缺陷型菌株从群体分离检出，检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹 层培养法、限量补给法、影印培养法。其中以逐个测定法最简单，把经过浓缩的缺陷型 菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养 基上14。凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。 4展望酵母有很多营养缺陷型标记，在进行突变株的筛选中较方便，酵母作为一种安全、简便、有效的 模式生物广泛适用医学科研。近来的工业微生物技术针对传统微生物催化工业中的关键技术和热点问 题，展开了更为细致和具体的研究，成为工业发展的直接推动力。同时，基因组及代谢网络等基础 研究在生物工艺方面的应用，使工业微生物技术从基因水平出发，在更多的微生物资源中寻找催 化合成工具，在更深层次上探讨催化调控方法，呈现出空前广阔的发展前景。参考文献：1. 吕宪峰,毛得奖. 啤酒酵母絮凝机理研究进展. 酿酒科技,2006,4:87-90.2. 张博润,任健,刘玉方. 酵母菌絮凝机理研究进展及应用前景. 微生物学通报, 1996, 23(5): 307-311.3. 刘 楠,王冬立,何秀萍等. 酵母新絮凝特性的研究进展及应用展望. 食品与发酵工 业,2007,33(1):89-91.4. 张博润,任健,刘玉方. 酵母菌絮凝机理研究进展及应用前景. 微生物学通报, 1996, 23(5): 307311.汪芳自絮凝酵母酒精连续发酵耦合废糟液全循环工艺D;天津大学学报;2010,4(3):25-29.6 . 张敏,曹燕子,李志斌. 燃料乙醇研究概况及发展前景. 湖南科技学院学报,2007,28(4):89-91.7 .胡纯铿，白凤武,安利佳絮凝特性对自絮凝颗粒酵母耐酒精能力的影响及作用机制.生物工程学报,2005.21(1):123128.8 . 张博润,任健,刘玉方. 酵母菌絮凝机理研究进展及应用前景. 微生物学通报, 1996, 23(5): 307311.9 . 吕宪峰,毛得奖. 啤酒酵母絮凝机理研究进展. 酿酒科技,2006,4(6):87-90.10 .王镜岩,朱圣庚,徐长法.生物化学(下册).第3版.北京:高等教育出版 社,2004,5(16):396398,427435.11 .栾雨时,包永明. 生物工程实验技术手册.第 1 版.北京：化学工业出版 社,2005,8(29).129132,394395.12 .陈王君,林海，王正祥，等.双重筛选产甘油假丝酵母营养缺陷型菌株及其发酵性能.无锡轻工大 学学报，2000,19(2):9599.13 .彭帮柱岳田利袁亚宏定向选育氨基酸营养缺陷型苹果酒酵母突变株的研究J-西北农林科技 大学学报(自然科学版). 2007,22(4) :34-3714 .杨才华，张建国,魏赵军紫外线诱变选育桑葚酒发酵用酵母菌J.中国蚕业,2008,9(4):24-26.15 .李筝,韩北忠，陈晶瑜,李双石，等优良酿酒酵母的发酵性能测定J中国酿造,2008,26:10-12.16 .李用芳面包酵母原生质体的制备、再生及紫外诱变的初步研究J.生物技术,2000,10(2):23-27.17 何秀萍,刘增然，刘春秀,张博润酵母菌细胞自溶突变株的研究A 首届中国青年学者微生物遗传 学学术研讨会论文摘要集.C;2002,5(13):25-29.18 .房耀维,范琳,牛艳芳,等.工业微生物育种技术研究进展. 内蒙古师范人学学报自然科学(汉文) 版,2003,32(2):158-161.