课题3血红蛋白的提取和分离

课 题 3 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离专 题 5 DNA和 蛋 白 质 技 术 2003年 4月 14日 宣 布 人 类 基 因 组 序 列 图 完 成这 标 志 着 进 入 了 后 基 因 组 时 代 。人 类 基 因 组 ： 指 DNA分 子 所 携 带 的 全 部遗 传 信 息 。蛋 白 质 组 ： 生 物 个 体 表 达 的 蛋 白 质 分 子 的总 和 。 主 要 是 对 蛋 白 质 功 能 的 研 究 n n 新 华 网 首 尔 月 日 电 （ 记 者 干 玉 兰 ） 韩 国 浦 项 工业 大 学 科 学 家 日 宣 布 ， 他 们 已 查 明 可 抑 制 艾 滋 病 病 毒 感染 的 “ ” 蛋 白 质 核 心 部 分 的 结 构 。n 浦 项 工 业 大 学 生 物 科 学 系 教 授 吴 秉 夏 等 人 ， 当 天 公 开 了“ ” 蛋 白 质 内 核 心 部 分 “ ”的 三 维 分 子 结 构 ， 并 称 已 弄 清 楚 这 一 结 构 的 正 确 位 置 及 它 与其 他 结 构 之 间 的 相 互 作 用 。 研 究 成 果 发 表 在 最 新 一 期 分 子细 胞 杂 志 上 。n 2 年 英 国 自 然 杂 志 曾 刊 登 论 文 说 ， “ ” 蛋 白 质 可 有 效 抑 制 艾 滋 病 病 毒 的 感 染 。 此 后 ， 世 界 各地 的 很 多 科 学 家 开 始 研 究 “ ” 蛋 白 质 的 结 构 ， 但到 目 前 为 止 尚 未 有 人 宣 称 取 得 突 破 性 进 展 。 我 国 对 蛋 白 质 的 现 阶 段 研 究n n 我 国 独 立 主 持 国 际 “ 人 类 肝 脏 蛋 白 质 组计 划 ” ， 参 加 国 际 人 类 蛋 白 质 组 研 究 计 划 中 的“ 大 规 模 抗 体 制 备 ” 项 目n 思 考 1 分 离 生 物 大 分 子 的 基 本 思 路 是 什 么 ？选 用 一 定 的 物 理 或 化 学 的 方 法 分 离 具 有不 同 物 理 或 化 学 性 质 的 生 物 大 分 子 。思 考 2 蛋 白 质 的 分 离 和 提 取 的 原 理 是 什 么 ？根 据 蛋 白 质 各 种 特 性 的 差 异 ， 如 分 子 的形 状 和 大 小 、 所 带 电 荷 的 性 质 和 多 少 、溶 解 度 和 吸 附 的 性 质 和 对 其 他 分 子 的 亲和 力 等 等 ， 可 以 用 来 分 离 不 同 蛋 白 质 。 思 考 3 高 温 灭 菌 和 酒 精 灭 菌 分 别 利 用 蛋 白 质的 何 种 作 用 ， 作 用 结 果 是 什 么 被 破 坏 ？变 性 、 变 性 、 空 间 结 构思 考 4 人 们 用 鸡 的 红 细 胞 提 取 DNA， 用 人 的 红 细 胞 提 取 血 红 蛋 白 的 原 因 是 什 么 ？鸡 的 红 细 胞 具 有 细 胞 核 ， 含 有 DNA， 便于 进 行 DNA的 提 取 ， 人 的 红 细 胞 无 细 胞核 ， 结 构 简 单 ， 血 红 蛋 白 含 量 丰 富 便 于提 取 血 红 蛋 白 。 一 、 基 础 知 识 ： 凝 胶 色 谱 法 （ 分 配 色 谱 法 ） ： 1、 凝 胶 ：一 些 微 小 多 孔 的 球 体 （ 内 含 许 多 贯 穿 的通 道 ， 由 多 糖 类 构 成 如 葡 聚 糖 、 琼 脂 糖 ，具 多 孔 的 凝 胶 就 叫 分 子 筛 ） 2、 概 念 ： 根 据 被 分 离 物 质 的 蛋 白 质 相 对分 子 质 量 的 大 小 ， 利 用 具 有 网 状 结 构 的 凝胶 的 分 子 筛 作 用 ， 来 进 行 分 离 。 3、 原 理 ： 当 不 同 的 蛋 白 质 通 过 凝 胶 时 ， 相对 （ ） 的 蛋 白 质 容 易 进 入凝 胶 内 部 的 通 道 ， 路 程 （ ） ， 移 动 速度 （ ） ， 而 （ ） 的 蛋 白质 无 法 进 入 凝 胶 内 部 的 通 道 ， 只 能 在（ ） 移 动 ， 路 程 （ ） ， 移 动 速度 （ ） ， 相 对 分 子 质 量 不 同 的 蛋 白 质 因此 得 以 分 离 。4、 具 体 过 程相 对 分 子 质 量 较 小 较 长较 慢 相 对 分 子 质 量 较 大凝 胶 外 部 较 短较 快 凝 胶 色 谱 法 分 离 蛋 白 质 的 原 理 1、 概 念 ： 在 一 定 的 范 围 内 ， 能 对 抗 外来 少 量 强 酸 、 强 碱 或 稍 加 稀 释 不 引 起 溶 液PH 发 生 明 显 变 化 的 作 用 叫 做 缓 冲 作 用 ， 具有 缓 冲 作 用 的 溶 液 叫 做 缓 冲 溶 液 。 缓 冲 溶 液 ： 2、 作 用 ： 能 够 抵 制 （ ） 的 对 溶 液的 （ ） 的 影 响 ， 维 持 PH 基 本 不 变 。外 界 的 酸 或 碱PH 值 3、 缓 冲 溶 液 的 配 制 通 常 由 （ ） 种 缓 冲 剂 溶 解 于 水中 配 制 而 成 。 调 节 缓 冲 剂 的 （ ）就 可 以 制 得 （ ） 使 用 的缓 冲 液 。 1 2 使 用 比 例在 不 同 PH 范 围 内 思 考 ： 说 出 人 体 血 液 中 缓 冲 液 。 NaH 2PO4 / Na2H PO4H 2CO3 / NaH CO3 电 泳 ：1、 概 念 ： 指 带 电 粒 子 在 电 场 作 用 下 发生 迁 移 的 过 程 。 在 血 红 蛋 白 整 个 实 验 室 中 用 的 缓 冲液 是 磷 酸 缓 冲 液 ， 目 的 是 利 用 缓 冲 液 模拟 细 胞 内 的 PH环 境 ， 保 证 血 红 蛋 白 的 正常 结 构 和 功 能 ， 便 于 观 察 （ 红 色 ） 和 材料 的 科 学 研 究 （ 活 性 ） 2、 原 理 ： 许 多 重 要 的 生 物 大 分 子 ， 如（ ） 等 都 具 有 ( ) 在 ( )下 ， 这 些 基 团 会 带 上（ ） 。 在 电 场 的 作 用 下 ， 这 些 带电 分 子 会 向 着 与 其 （ ） 移 动 。 电 泳 利 用 了 待 分 离 样 品 中 各 种 分 子（ ） 以 及 分 子 本 身（ ） 、 （ ） 的 不 同 使 带 电 分 子产 生 不 同 的 （ ） ， 从 而 实 现 样品 中 各 种 分 子 的 分 离 。多 肽 、 核 酸 可 解 离 的 基 团正 电 或 负 电 所 带 电 荷 相 反 的 电 极带 电 性 质 的 差 异大 小 形 状迁 移 速 度一 定 的 PH 分 类 ：琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 电 泳 。测 定 （ ） 通常 用 十 二 烷 基 硫 酸 钠 （ SDS） 聚 丙 稀酰 胺 凝 胶 电 泳蛋 白 质 相 对 分 子 质 量 为 了 消 除 静 电 荷 对 迁 移 率 的 影 响 可 以 在 凝 胶中 加 入 ( )。 SDS能 使 蛋 白 质 发 生 完 全 变 性 。由 几 条 肽 链 组 成 的 蛋 白 质 复 合 体 在 SDS的 作 用下 会 解 聚 成 单 条 肽 链 ， 因 此 测 定 的 结 果 只 是( )。 SDS能 与 各 种 蛋 白 质形 成 蛋 白 质 SDS复 合 物 ， SDS所 带 负 电 荷 的量 大 大 超 过 了 蛋 白 质 分 子 原 有 电 荷 量 。 因 而掩 盖 了 不 同 种 蛋 白 质 间 的 电 荷 差 别 ， 使 电 泳迁 移 率 完 全 取 决 于 ( )。 蛋 白 质 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 的 迁 移 率 取 决 于它 所 带 静 电 荷 的 多 少 以 及 分 子 的 大 小 等 因 素 。SDS单 条 肽 链 的 分 子 量 分 子 的 大 小 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 对 分 离 大 分 子 具 有较 高 的 分 辨 率 ， 但 核 酸 比 蛋 白 质 分 子 大得 多 ， 只 能 采 用 较 大 孔 径 的 琼 脂 糖 凝 胶电 泳 。 核 酸 分 子 本 身 含 有 大 量 的 磷 酸 根 ，核 酸 带 负 电 荷 ， 在 电 场 中 向 正 极 移 动 。溴 化 乙 啶 荧 光 染 料 对 核 酸 染 色 在 紫 外 线的 照 射 下 ， 发 出 橙 红 色 荧 光 。 根 据 荧 光条 带 的 粗 细 和 分 布 的 位 置 ， 可 以 对 其 鉴定 。 说 明 ： 电 泳 检 测 结 果 （ 四 ） 血 红 蛋 白n 在 红 细 胞 的 组 成 中 ，约 90%是 血 红 蛋 白 。它 由 四 个 肽 链 组 成 ，包 括 两 个 肽 链 和两 个 肽 链 。 每 条肽 链 环 绕 一 个 亚 铁 血红 素 基 团 ， 可 携 带 一分 子 氧 或 一 分 子 二 氧化 碳 。 血 红 蛋 白 因 含血 红 素 而 呈 现 红 色 。 二 、 实 验 操 作n 蛋 白 质 的 提 取 和 分 离 一 般 分 为 四 步 ：n （ 1） 样 品 处 理 ： 包 括 洗 涤 红 细 胞 ； 血 红 蛋白 稀 释 ； 离 心 等 操 作 收 集 到 的 血 红 蛋 白 溶液 。n （ 2） 粗 分 离 ： 透 析 除 去 分 子 较 小 的 杂 质 。n （ 3） 纯 化 ： 通 过 凝 胶 色 谱 法 将 分 子 量 较 大的 杂 质 蛋 白 质 除 去 。n （ 4） 纯 度 鉴 定 ： 通 过 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳鉴 定 。 二 实 验 操 作蛋 白 质 的 提 取 和 分 离 一 般 分 为 四 步 ：1.样 品 处 理血液 血 浆 水 分固 体 物 质 血 浆 蛋 白无 机 盐磷 脂葡 萄 糖 等血 细 胞 白 细 胞血 小 板红 细 胞（ 最 多 ） 血 红蛋 白 （ ） 两 个 a 肽 链两 个 一 肽 链 样 品 处 理 粗 分 离 纯 化 纯 度 鉴 定共 四 条 肽 链90 （ 一 ） 样 品 处 理n 1、 红 细 胞 的 洗 涤 ：n 目 的 是 去 除 杂 蛋 白 。 要 加 入 柠 檬 酸 钠 防 止 血 液 凝固 ； 离 心 将 血 液 分 层 ， 用 胶 头 吸 管 吸 出 黄 色 血 浆 ；用 生 理 盐 水 洗 涤 。n 2、 血 红 蛋 白 的 释 放 ：n 在 蒸 馏 水 和 甲 苯 作 用 下 ， 红 细 胞 破 裂 释 放n 3、 分 离 血 红 蛋 白 溶 液 ：n 离 心 分 层 ； 滤 纸 过 滤 去 除 脂 溶 性 沉 淀 层 ； 分 液 漏斗 分 出 红 色 透 明 液 体 。 n 4、 透 析 ：n 装 入 透 析 袋 并 置 于 磷 酸 缓 冲 液 中 （ PH为 7.0） 透析 。 红 细 胞 的 洗 涤 分 离 血 红 蛋 白 溶 液有 机 溶 剂 无 色 透 明 的 甲 苯 层脂 类 物 质 白 色 脂 溶 性 物 质 沉 淀层血 红 蛋 白 溶 液 红 色 透 明 液 体红 细 胞 破 碎 物 沉 淀 暗 红 色 沉 淀物 练 习 巩 固1、 随 着 人 类 跨 入 蛋 白 质 组 时 代 ， 对 蛋白 质 的 研 究 和 应 用 越 来 越 深 入 ， 首 先 要做 的 一 步 是A 弄 清 各 种 蛋 白 质 的 空 间 结 构B 弄 清 各 种 蛋 白 质 的 功 能C 弄 清 各 种 蛋 白 质 的 合 成 过 程D 获 得 高 纯 度 的 蛋 白 质 2、 用 凝 胶 色 谱 法 分 离 蛋 白 质 的 过 程 中 ，关 于 蛋 白 质 的 叙 述 ， 正 确 的 是A 相 对 分 子 质 量 较 小 的 蛋 白 质 行 程 大 于相 对 分 子 质 量 较 大 的 蛋 白 质B 相 对 分 子 质 量 较 小 的 蛋 白 质 行 程 小 于相 对 分 子 质 量 较 大 的 蛋 白 质C 相 对 分 子 质 量 较 小 的 蛋 白 质 行 程 等 于相 对 分 子 质 量 较 大 的 蛋 白 质D 二 者 根 本 无 法 比 较 3、 使 用 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 电 泳 过 程 中 ， 不同 蛋 白 质 的 电 泳 迁 移 率 完 全 取 决 于A 电 荷 的 多 少 B 分 子 的 大 小C 肽 链 的 多 少 D 分 子 形 状 的 差 异4、 在 采 血 容 器 中 加 入 柠 檬 酸 钠 的 目 的 是A 调 节 pH B 维 持 红 细 胞 的 能 量 供 应C 防 止 微 生 物 生 长 D 防 止 血 液 凝 固 5、 一 分 子 血 红 蛋 白 最 多 可 携 带 的 O2分 子数 和 CO2分 子 数 分 别 是A 4、 2 B 4、 4 C 2、 1 D、 1、 16、 记 住 样 品 处 理 中 的 血 红 蛋 白 溶 液 离 心 后分 层 顺 序 自 上 而 下 是 ：有 机 溶 剂 -脂 类 物 质 -血 红 蛋 白 溶 液 -红 细 胞 破 碎 物 沉 淀