遗传的物质基础-DNA

教 学 目 的 ： 学 习 分 子 遗 传 学 的 基 本 理 论 ，重 点 是 遗 传 物 质 在 分 子 水 平 上 的 遗 传 信 息 流向 和 基 因 表 达 调 控 。 利 用 分 子 遗 传 学 的 基 本理 论 指 导 相 关 科 研 工 作 。教 学 组 织 ： 教 师 讲 述 和 学 生 自 学 结 合 。成 绩 评 价 ： 课 程 论 文 （ 50%） ； 按 指 定 题目 在 规 定 时 间 内 完 成 。 闭 卷 考 试 （ 50%） 。参 考 书 籍 ： 分 子 遗 传 学 。 南 京 大 学 分 子 遗 传 学 ， 张 玉 静 95年 以 后 出 版 的 分 子 生 物 学 教 材 或 专 著 第 一 章 遗 传 的 物 质 基 础 DNA DNA is the genetic material 原 核 细 胞 和 真 核 细 胞 原 核 真 核细 胞 结 构 多 为 单 细 胞 , 多 细 胞 ,含 多 种 细 胞 器 , 无 细 胞 核 ,无 核 膜 、 有 完 整 的 核 结 构 核 仁遗 传 物 质 一 条 染 色 体 ， 一 般 多 条 染 色 体 , 裸 露 核 酸 分 子 , 核 小 体 结 构 ,经 雌 雄 配 子 通 过 质 粒 介 导 进 行 进 行 遗 传 物 质 交 流 单 向 遗 传 物 质 交 流其 他 功 能 无 溶 酶 体 ,不 能 通 过 有 吞 噬 和 胞 饮 作 用 , 吞 噬 和 胞 饮 作 用 进 行 电 子 传 递 在 线 粒 体 膜 异 物 的 消 化 ， 电 子 传 递 在 细 胞 膜 一 、 DNA所 带 的 遗 传 信 息作 为 遗 传 物 质 所 应 具 备 的 条 件多 样 性 贮 存 并 表 达 多 种 遗 传 信 息连 续 性 准 确 传 递 后 代稳 定 性 物 理 、 化 学 性 质 稳 定多 变 性 有 遗 传 变 化 的 能 力 DNA是 遗 传 物 质的 证 明1928年 Griffith的 肺炎 球 菌 对 小 鼠 的 转化 1944年 Avery对 肺 炎 球 菌 的 转 化 1952 Hershey 等 利 用 噬 菌 体 的 捣 碎 试 验 1952年 病 毒 重 组 真 核 细 胞的 基 因 转 化 1953年 Watson和 Crick， DNA双 螺 旋 模 型 核 酸 之 外 的 遗 传 物 质克 雅 氏 病 1913库 鲁 病 （ kuru） 1950羊 搔 痒 病 （ scrapie） 1959疯 牛 病 1985共 同 特 征 ： 退 行 性 神 经 疾 病 ， 影 响 大 脑 功 能 ， 大脑 细 胞 死 亡 。 过 滤 性 因 子 ， 可 感 染 ， 能 被 蛋 白 质酶 灭 活 ， 但 不 能 被 核 酸 酶 或 UV灭 活 ， 朊 病 毒 （prion） ， 即 蛋 白 质 样 的 感 染 粒 子 遗 传 信 息负 责 蛋 白 质 氨 基 酸 组 成 的 信 息 结 构 基 因基 因 选 择 性 表 达 的 信 息 调 控 基 因高 等 生 物 的 结 构 基 因 占 基 因 组 的 10-15%，占 基 因 组 80%以 上 的 DNA有 什 么 作 用 ？ 无 准确 的 回 答 。 与 基 因 表 达 的 调 控 有 关 。 二 、 DNA的 一 级 结 构DNA分 子 中 的 核 苷 酸 排 列 顺 序通 过 测 序 确 定拟 南 芥 ， 水 稻 ， 人 类 、 家 蚕一 般 写 法 ： 5pApCpApGpT3 ACAGT A GT C3-5磷 酸 二 脂 键 三 、 DNA的 二 级 结 构 Watson-Crick的 DNA双 螺 旋 的 特 征主 链 右 手 双 螺 旋 ， 脱 氧 核 糖 和 P为 骨 架 ， 位 于外 侧 ， 反 向 平 行 螺 旋 ,直 径 2nm碱 基 配 对 位 于 内 侧 ， 嘌 呤 和 嘧 啶 （ A-T,G-C）螺 旋 参 数 任 一 条 链 绕 轴 一 周 的 升 降 的 距 离 。 3.4nm， 10对 核 苷 酸 ， 相 邻 碱 基 0.34nm。大 沟 和 小 沟 骨 架 双 链 在 螺 旋 轴 上 的 间 距 不 等 ， 在DNA表 面 形 成 宽 窄 不 等 的 大 小 沟 。大 沟 宽 2.2nm， 是 蛋 白 质 识 别 DNA双 螺 旋 结 构 上 的特 定 信 息 位 点 。小 沟 宽 1.2nm。 决 定 双 螺 旋 稳 定 的 因 素1、 氢 键 结 构 的 稳 定 性 与 G+C的 含 量 成 正 比， G-CA-T.2、 碱 基 堆 积 力 嘌 呤 和 嘧 啶 具 疏 水 性 ,产 生 疏 水 区而 与 介 质 分 开 ,使 碱 基 与 水 的 接 触 为 最 小 。3、 其 他 带 负 电 荷 的 磷 酸 基 与 介 质 中 的 阳 离 子 形成 离 子 键 ,可 有 效 地 屏 蔽 磷 酸 基 间 的 静 电 斥 力 。 四 、 DNA物 理 结 构 的 不 均 一 性富 含 A+T的 序 列 AT含 量 在 染 色 体 的 不 同 区 域 不 同 ， 螃蟹 卫 星 DNA的 AT含 量 高 达 97%。 AT区 域 对 复 制 和 转 录的 起 点 很 重 要 。嘌 呤 和 嘧 啶 的 排 列 顺 序碱 基 组 成 相 同 ， 但 排 列 不 同 ， 双 螺 旋 的 稳 定 性 有 差 别5GC5CG ， 和 碱 基 堆 积 力 有 关 ， 碱 基 堆 聚 力 是 嘌 呤向 嘧 啶 方 向 大 于 嘧 啶 向 嘌 呤 方 向 。Tm值 ， DNA熔 解 温 度双 螺 旋 失 去 一 半 时 的 温 度 ， GC含 量 与 Tm成 正 比 。 Tm值 低 的 双 链 容 易 解 开 ， 复 制 起 点 的 核 苷 酸 多 为 TA 反 向 重 复 序 列 回 文 序 列 （ palindrome） 形 成 发 夹 结 构 ， 十 字 形 结 构 ，是 限 制 酶 的 酶 切 位 点 。 A-DNA相 对 湿 度 75 以 下 ， 右 手 双 螺 旋 ，双 链 反 向 平 行 ， 每 周 螺 旋 10.9对碱 基 ， 螺 距 0.26nm ， 碱 基 平 面 不与 螺 旋 轴 垂 直 ， 大 沟 极 深五 、 DNA双 螺 旋 结 构 的 基 本 形 式 B DNA天 然 状 态 DNA， 相 对 湿 度 92 。 右 手 双 螺 旋 ， 每 周螺 旋 10对 碱 基 (10.4)， 螺 距 3.4nm， 碱 基 平 面 与 螺 旋 轴垂 直 ， 大 沟 宽 而 深 。 Z DNA左 手 双 螺 旋 ， 每 圈 螺 旋 12对 碱 基 ， 螺 距 4.6nm， 碱基 平 面 与 螺 旋 轴 不 垂 直 ， 无 大 沟 ， 小 沟 深 而 窄 其 他形 式四 链 DNA 三 链 DNA 一 条 DNA链 为 全 嘌 呤 ， 另 一 条 链 为 全 嘧啶 的 区 段 产 生 ， 结 果 一 条 嘌 呤 链 和 两 条 嘧啶 链 构 成 ， H-DNA. 与 DNA 的 复 制 可 能 有 关 。 一 条 嘌 呤 和 两 条 嘧 啶 链 构 成 ， (YR*Y)CG *C， TA*T星 号 左 边 的 碱 基 正 常 配 对 ， 右 边 的 碱 基 异 常 配 对 或 两 条 嘌 呤 和 一 条 嘧 啶 链 构 成 (YR*R) CG*G， TA*A， CG*A。 GGGA CA AT C 六 、 DNA的 变 性 和 复 性变 性 ： 热 ， 试 剂 ， 氢 键 、 碱 基 堆 积 力 破 坏 ，DNA由 双 链 变 成 单 链温 度 ： 80 100变 性 剂 ： 尿 素 ， 甲 酰 胺增 色 效 应 （ hyperchromicity）正 常 双 链 （ 50 g/ml） A260=1.00完 全 变 性 的 单 链 DNA A260=1.37单 核 苷 酸 A260=1.60DNA双 螺 旋 结 构 失 去 一 半 时 ， A 260=1.185 Tm值 的 影 响 因 素 ：DNA的 均 一 性 均 一 性 高 ， Tm值 的 范 围 小G-C含 量 G-C含 量 高 ， Tm值 高经 验 公 式 G-C%=(Tm-69.3) 2.44介 质 中 的 离 子 强 度 低 离 子 强 度 易 熔 解 变 性 DNA保 存 在 高 浓 度 缓 冲 液 中 防 变 性 （ TE） 复 性单 链 重 新 缔 合 为 双 螺 旋 的 过 程 ， 一 般 比 Tm低20 25 下 进 行 复 性过 程 ： 复 性 时 溶 液 中 单 链 DNA随 机 碰 撞 。 GC先 配 对 形 成 短 的 双 链 ， 然 后 配 对 区 域 延 伸 ， 象拉 链 一 样复 性 产 生 的 不 一 定 是 原 有 的 互 补 链 ， 非 原 配 影 响 DNA复 性 的 因 素 ：DNA复 杂 性 简 单 序 列 复 性 快DNA浓 度 高 浓 度 复 性 快DNA片 断 片 断 小 复 性 快 ， 移 动 碰 撞 机 会 多温 度 过 低 温 度 减 少 互 补 链 的 碰 撞 机 会盐 浓 度 过 低 盐 浓 度 使 复 性 后 的 DNA又 变 性 杂 交 ：不 同 来 源 的 单 链 核 酸 经 碱 基 互 补 配 对 而 形成 的 双 螺 旋 ， DNA-DNA, DNA-RNADNA杂 交 可 反 映 不 同 生 物 中 DNA的 共 同序 列 和 不 同 序 列 ， 研 究 生 物 的 进 化 ， 核 酸 杂 交 是 现 代 分 子 生 物 学 的 基 础 液 相 杂 交 滤 膜 杂 交 Cot曲 线DNA复 性 时 的 单 链 消 失 的 速 度 1C/Co= 1+KCotC： 单 链 DNA浓 度 ， Co： DNA总 浓度 ， t： 时 间 秒 ， k： =二 级 反 应 常 数复 性 的 分 数 C/Co是 起 始 浓 度 和 经 过时 间 的 乘 积 （ Cot） 的 函 数 。 Cot曲 线 定 义 C/Co=1/2时 ， Cot值 定 义 为 Cot1/2； 即 复性 一 半 时 DNA总 浓 度 和 时 间 乘 积 11/2= 1+Kcot1/2 1+KCot 1/2=2 Cot1/2=1/k不 同 DNA的 Cot1/2 值 不 同 ， 总 DNA浓 度 相 同时 ， 片 断 越 短 ， Cot1/2 值 越 小 ， DNA复 杂 性越 高 ， 复 性 越 慢 ， 基 因 组 大 复 性 慢 . DNA复 杂 性 （ X） ：最 长 的 没 有 重 复 序 列 的 DNA核 苷酸 对 的 数 值 ：ATATAT-, X=2ATGC-, X=4 X=KCot1/2 七 、 DNA超 螺 旋 结 构生 物 体 中 大 多 数 DNA是 以 超 螺 旋 的 形 成 存 在 ，而 缺 少 超 螺 旋 的 DNA则 为 松 弛 型 DNA原 核 生 物 DNA， 共 价 封 闭 环 ， 再 经 螺 旋 就 成 为超 螺 旋真 核 生 物 DNA为 线 性 ， DNA与 蛋 白 质 结 合 之 间的 DNA可 形 成 一 个 小 “ 环 ” ， 类 似 共 价 封 闭 环， 从 而 螺 旋 成 为 超 螺 旋 正 超 螺 旋 ： 和 DNA内 部 双 螺 旋 缠 绕 方 向 相 同 的 方 向 缠 绕形 成 的 超 螺 旋 ， 结 构 更 加 紧 密 。 DNA每 圈 初 级 螺 旋 的 碱 基 对 小 于 10.5， 则 为 正 超 螺 旋 。 负 超 螺 旋 ： DNA绕 其 轴 与 右 手 双 螺 旋 方 向 相 反 的 方 向 缠 绕所 产 生 的 超 螺 旋 ， 结 果 减 少 每 个 碱 基 对 的 旋 转 ， 每 圈 初 级螺 旋 的 碱 基 对 大 于 10.5， 则 为 负 超 螺 旋 。超 螺 旋 是 耗 能 过 程 ， 超 螺 旋 的 产 生 可 能 为 能 量 的 储 存 形 式 拓 扑 异 构 酶 催 化 DNA链 断 裂 和 重 新 连 接 。 每 次 只 作 用 于 一 条单 链 ， 无 需 ATP， 功 能 是 松 弛 DNA， 代 表 ： E.coli拓 扑 异 构 酶 ， 对 单 链 DNA的 亲 和 力 比 双链 高 ， 能 识 别 负 超 螺 旋 区 ， 使 负 超 螺 旋 扩 大 化 而成 松 弛 状 ， 该 酶 不 能 松 弛 正 超 螺 旋真 核 生 物 拓 扑 异 构 酶 可 结 合 15-19核 苷 酸 的 双 链区 域 ,其 断 裂 点 在 此 区 域 中 间 .该 酶 倾 向 于 结 合 超螺 旋 而 不 是 结 合 松 弛 DNA区 域 ,对 正 负 超 螺 旋 都 有松 弛 功 能 . 拓 扑 异 构 酶 大 肠 杆 菌 拓 扑 异 构 酶 又 称 DNA旋 转 酶 (DNA gyrase)， 能 催 化 断 裂 和 连 接 双 链 DNA， 需 能 量ATP参 与 ， 无 碱 基 序 列 特 异 性 ， DNA旋 转 酶 结 合 到 双 链 闭 环 分 子 中 在 ATP的 作用 下 产 生 负 超 螺 旋 。 无 ATP时 只 能 缓 慢 松 弛 负 超螺 旋 而 不 能 松 弛 正 超 螺 旋 。 大 肠 杆 菌 拓 扑 异 构 酶 主 要 功 能 是 引 入 负 超螺 旋 以 抵 消 复 制 叉 移 动 所 产 生 的 正 超 螺 旋 ， 还具 有 形 成 或 拆 开 双 链 DNA环 连 体 的 能 力 。 该 酶 对 DNA的 结 合 顺 序 是 正 超 螺 旋 松 弛 负超 螺 旋 拓 扑 异 构 酶 的 生 物 学 功 能 恢 复 细 胞 过 程 产 生 的 DNA超 螺 旋 ， 如 复制 叉 前 的 正 超 螺 旋 、 转 录 时 聚 合 酶 前 产 生 的正 超 螺 旋 。 防 止 细 胞 DNA过 度 超 螺 旋 ， 维 持 超 螺 旋的 稳 定 水 平 。 生 物 体 内 5 负 超 螺 旋 ， 有 利于 基 因 的 转 录 、 基 因 组 稳 定 、 促 进 重 组 。 去 连 环 活 性 （ 大 肠 杆 菌 ） 、 染 色 体 凝 缩（ 真 核 ） 、 解 开 缠 绕 DNA双 螺 旋 拓 扑 异 构 酶 的 催 化 反 应 本 质 是 先切 割 DNA的 磷 酸 二 脂 键 ， 改 变DNA链 环 数 后 再 连 接 ， 兼 具 DNA内 切 酶 和 DNA连 接 酶 的 功 能 ， 但是 它 不 能 连 接 事 先 已 经 存 在 的 断裂 DNA， 是 DNA复 制 、 重 组 和 转录 中 必 需 的 酶 八 、 常 见 DNA分 子 形 式 及 相 互 关 系 沉 降 系 数 ： Cscl密 度 梯 度 离 心 时 的 表 示 单 位 。 Cscl本 身 有 梯 度 ， 在 离 心 时 将 不 同 分 子 大 小 的 物 质 集 中 到它 自 身 的 不 同 梯 度 中 。 在 同 一 种 密 度 梯 度 离 心 条 件 下 ， 沉 降 系 数 大 表 示 易沉 淀 ， 则 具 有 较 高 的 超 螺 旋 。 鉴 定 DNA超 螺 旋 的 手段 。 型 DNA 具 正 、 负 超 螺 旋 的双 链 环 状 DNA S 1.41 型 DNA 无 超 螺 旋 的 双 链环 状 D N A ， 是 松 弛 型 S=1.14 型 DNA 一 条 链 或 两 条 链 上有 一 个 或 几 个 切 口 的 双 链 环状 DNA S=1.14 型 DNA 线 形 双 链 DNA S=1.00崩 溃 DNA 型 或 型 DNA变 性 时 ， 氢 键 断 裂 但 两 条 链无 法 分 离 而 紧 密 缠 绕 的 分 子 S=3.0单 链 环 状 DNA S=1.14线 状 单 链 DNA S=1.30 连 环 状 DNA 两 个 型 DNA环 连 而 成 。 S1.41 本 章 要 点作 为 遗 传 物 质 的 条 件DNA作 为 遗 传 物 质 的 证 明DNA的 一 级 、 二 级 结 构 的 特 点 与遗 传 物 质 条 件 间 的 关 系Tm和 Cot曲 线 对 DNA研 究 的 意 义