怎样分离纯化酶

怎样分离纯化酶这是一门很深的学问，除了需要高科技还需要科研专用设备，只是简介，希望对你有帮助，不要上当受骗: 酶的分离纯化方法简介生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都 是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般 含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内 酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的， 在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能 有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中 期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝 乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综 合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶 制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖 快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质， 因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低 的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶 的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始 终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着 一步骤的取舍。酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液， 此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除 去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术1. 细胞破碎（cell disruption）高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下 通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器 的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率，起码要将菌 悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力，减少操作次数。但有人报道，当操作压力达到175Mpa时， 破碎率可达100%。当压力超过70Mpa时，细胞破碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎 率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养 基上生长的大肠菌更难破碎。容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。具体做法是：溶壁微球菌 （micrococcus lysodeikticus）43kg，置于0.5%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5%（干重），在35。用0.68kg （干重）的蛋清处理20min，得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质 除去，再将乙醇浓度提高到75% （体积分数），可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。2. 离心离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型，所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离 心机和离心机。过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔，壁上有过滤介质，一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、 固体含量较高的场合。沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离，如发酵液中的菌体，用盐析法或 有机溶剂处理过的蛋白质等。分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微 粒的乳浊液。在生物领域采用的离心机系统，除了应具备离心机的一般要求外，还应满足生物生产的技术要求，这包括 灭菌、冷却、密封，以保证产品不受污染并不污染环境。现代哦离心机装置包括以下三个步骤，并进行程 序控制：离心、离心系统的灭菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司离心机产品的装置，具有双重轴向密封，密 封由装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成，密封由水连续冷却和润滑，可防止产品被污染，也可 防止生产过程中排出的废物对环境的污染。该离心机又如一个密闭的压力容器，可在121 C温度下进行蒸 汽灭菌，该离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套，对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却，并能 有效地控制温度，这对于生物制品是非常重要的。如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化 和细胞碎片的分离，可用于疫苗、酶制剂等的提取。该机的其他辅助系统及控制系统也较为完善，如设有 压力指示器、力量计、温度传感器和液面传感器。3. 膜分离技术在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜，使溶 液中分子量较小的溶质透过薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较 厚的支撑膜结合在一起而组成的。功能膜决定了膜的孔径，而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。超滤浓 缩的优点是：操作条件温和，无相变化，对生物活性物质没有破坏。超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成，料液经泵打入超滤器，水及低分子量物质排 出超滤器外，被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一 步处理的浓缩料液。超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问题：第一，在超滤循环过程中，由于泵和叶 轮与料液的摩擦放热作用，料液的温度会逐渐升高，会造成蛋白质分子的损失。因此，料液贮罐应加冷却 系统，并安装自动测温及控制系统。第二，某些酶的辅助因子散失为问题：一些酶含有辅助因子，其分子 量小，超滤时易从透过液中排除掉，因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。还可将超滤与亲和层析相结合以提高分离纯度。其工作原理是：当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍地通 过超滤膜的孔隙时，如果在膜的一侧结合着亲和配基，该蛋白质就会与配基结合因而结聚在膜的这一侧。 不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来，洗脱液用于进一 步的分离纯化。4. 泡沫分离原理：将气体通入含多种组分的溶液中，由于这些组分的表面活性由差异，因此在溶液的表面，某些组分 将形成泡沫，泡沫的稳定性取决于操作条件及溶液的生物学特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡 沫的组分种类及其含量与溶液中的不相同。这样，溶液中的组分舅得以分离。蛋白质较易吸附与气液界面，这有利于其结构的稳定。泡沫分离过程是：蛋白质从主体溶液中扩散到气液 界面，该过程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子发生重排，一般认为在空气水界面会形成两种类型的 膜，一种是稀膜，另一种是浓膜，可能会发生由多个分子聚集在一起的现象。在气液界面形成的蛋白质膜 可以是单层的也可以是多层的。膜的类型取决于主体溶液及气液界面上蛋白质的特性、结构和浓度。泡沫分离的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白质的浓度/最初溶液中蛋白质浓度），另一方面 提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白质的提取率/最初的蛋白质质量），或使多组分混合物中某一组分的分配 系数最大。二、抽提沉淀1. 盐析常用的盐析剂是硫酸铵，其溶解度大、价格便宜。硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强，其饱和溶液能使大多数 的蛋白质沉淀下来。对酶没有破坏作用。pH的控制：应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑，在酶等电点时其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等电 点时稳定性较差，因此要选择最佳pH值.一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜酶沉淀的pH 值。在操作中一旦确定最佳pH值后，在添加硫酸铵之前甲酸或碱调节好酶液的pH值，要尽量避免溶液 pH值的波动以免破坏酶的稳定性。在添加硫酸铵时要注意搅拌，并注意硫酸铵的加入速度，一般是由少到 多，缓慢加入，硫酸铵尽可能磨成细粉。温度的控制：有些酶在较高温度下稳定性能较好，可在常温下进行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在 低温下操作。酶液的净置：加完硫酸铵后，酶液要静置一段时间，使酶蛋白完全沉淀下来，酶静置后，就不要再加以搅 拌。2 .有机溶剂沉淀有机溶剂选择：可用于酶蛋白沉淀的有机溶剂包括醇类物质等，如甲醇、乙醇、异丙醇。乙醇的亲水性能 较好，可防止蛋白质的变性，酶蛋白在其中的溶解度也较低。有机溶剂沉淀操作：有机溶剂一般都使蛋白质变性，当温度较高时变性蛋白质分子就会变成永久失活。因 此用有机溶剂处理时最好在0C以下进行。用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白不要放置过久，要尽快加水溶解。3. 聚合物絮凝剂沉淀 聚合物絮凝剂，如葡聚糖和聚乙二醇，与酶分子争夺水分子，具有脱水作用使酶 沉淀。聚乙二醇作为一种沉淀剂的优点是在水溶液中，其浓度可达到50%，浓度为6%-12%的蛋白质大都 可以沉淀下来。这种试剂不需要低温操作，而且对蛋白质的稳定还有一定的保护作用。聚乙二醇不会被吸 附，故在离子交换吸附前不必去除。4. 用金属离子和络合物沉淀酶和其他蛋白质都会形成金属盐，其溶解度较低。用金属离子沉淀的缺点是酶与金属离子相互作用后，可 逆变化较差，尤其是用巯基衍生物，它结合的金属离子会催化酶变性而失活。5 .用特殊试剂沉淀法用链霉素可选择性去除核酸，从而使胞内酶沉淀出来。链霉素盐（浓度为0.5-1.0mg/mg蛋白质）对于选 择性沉淀核酸的效果比锰离子还要好，酶不易失活。6 .亲和沉淀将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量、地选择性有机结合形成了亲和沉淀技术。 将配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物，该复合物与生物分子结合后在一定条件下可以沉淀出 来。配基-载体复合物可以选择性地与蛋白质结合，溶液中的pH值、离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合 的影响力并不大，只有竞争性的配基会降低产物与原配基的亲和结合力，甚至使亲和结合发生逆转。引导产生沉淀的方法有：离子交联；加入带相反电荷的聚合物；加入带相反电荷的疏水基团；改变pH值， 诱导产生疏水沉淀；温度诱导产生沉淀。亲和结合：将亲和配基加入到含有目的物蛋白质的溶液中，调节好有关沉淀的条件，使之有利于亲和结合。 洗涤：为经过处理的粗制液中发生亲和沉淀可能会发生非特异性结合，尤其是使用带电的聚合物，离子交 换的效应将使其他蛋白质共同沉淀，因此在分离目的物之前要洗涤沉淀物。其做法是：加入适当的清洗剂 重新溶解沉淀，再沉淀；或在专一性洗脱之前，彻底清洗沉淀。在上述过程中要始终保持目的蛋白质与配 基处于亲和结合状态。配基-载体复合物与目的蛋白质的分离：分离结束之后，要确保回收目的蛋白质和配基-载体复合物，目的 蛋白质要达到一定的纯度，回收率要高。动物组织细胞分离纯化方法学姜俊芬（上海交通大学药学院，干细胞再生研究室）摘要 综述国内外动物组织细胞的分离纯化方法和最新进展。动物细胞的分离首要的是获得细胞悬液，本文 从物理、化学、生物三方面综合介绍了各种细胞悬液的获得方法。细胞悬液获得后就是目的细胞的纯化过 程，利用细胞的贴壁性质，大小、密度、带电性的差异及表面抗原等采用相应的方法即可达到纯化的目的， 本文也逐一进行了介绍，并分别列出了各种方法的优缺点，以供参考。在具体分离某种细胞时，应综合考 虑它的性质及试验成本等各方面，选择一种既经济又有效的方法。关键词 动物细胞 分离细胞悬液 纯化正文文字大小：大中小Several methods for separation and purification of animal cellsJIANG Jun-FenCollege of Pharmaceutics of Shanghai JiaoTong UniversityStem Cell Regeneration LaboratoryAbstract There are three kinds of techniques to obtain suspension of cells before the separation of them , namely physical , chemical and biological . Each kind has several methods . After that , we can purify the mixed cell suspension according to the cells size , density , property of electrification , exterior antigen and adhibition to the cultivation vessel and so on . Each method has its advantages and disadvantages .We should choose a feasible one depending on characters of the aim cell . Further more , the cost must be considered as well .Key words animal cells; isolation; cell suspension; purification如要了解某种特定细胞的结构、功能或表面标志等特征，就必须将其在体外培养增殖获得足够的数量以供 研究，这首先就必须获取种子细胞。从血液、淋巴液等液体中分离细胞时，可直接进行纯化，从心脏、肝 脏等器官分离细胞时，一般的方法是先获得细胞悬液，再对其进行分离、纯化。细胞的纯化可根据其大小、 密度、表面荷电、吸附能力或表面抗原的差异等而采用密度梯度沉降法、细胞电泳、贴附、亲和层析、花 环形成、补体介导杀伤溶解以及流式细胞仪（FCM）等各种方法来进行，本文对一些常用方法在比较的基础 上进行综述。一、 细胞悬液的获得细胞悬液的获得一般有三类方法：物理方法、化学方法、生物方法。物理方法即通过机械的研磨、振荡等 来获得单细胞悬液。化学方法是利用一些特殊的化学试剂，通过化学反应破坏细胞间的联接。生物方法现 在用的最普遍的就是酶消化法，即利用特定的酶溶液溶解、破坏细胞间联接。（一）物理方法一机械法1 .研磨法即通过简单的机械研磨后，过滤去除结缔组织等杂质，并进一步过滤以获得单细胞悬液，此法一般是针对 脆性较大的组织，虽简单易行，无需特殊设备，但对细胞损伤相对较大，且采用过滤法分离获得的细胞纯 度不是很高。2.振荡法即通过机械振荡使细胞分离，再过滤获得单细胞悬液。此法一般针对细胞间联接不是非常紧密的组织，操 作简单，对设备要求不高，但分离效果不理想，细胞所含杂质较多。3 .直接分离法1此法较简单，一般操作如下：原位灌注灌注液一般为D-Hanks液（含0.25%小牛血清，125U/mL肝素， pH值调至7.4）一取组织一剪切一清洗一过滤一离心（反复）一制成细胞悬液。此法分离获取的细胞产量 较高，细胞形态完整，分散度好，背景干净，杂质少。但细胞活性不佳，功能较差，且随着细胞培养时间 的延长，细胞活性及功能逐渐下降，故不适于一些持续时间较长的实验研究。由此可见，机械法虽操作简单，成本低，所分离的细胞膜上的蛋白质成分性质不易发生改变，但有时对细 胞损伤严重，且细胞间通过桥粒联接等多种方式紧密连接，一般的机械法很难使细胞分离，故获得的细胞 数量少且功能活性低，现在很少用。（二）化学方法一鳌合法Ca2 +、Mg2+等在细胞间桥粒联接中起重要作用，鳌合剂（EDTA，EGTA，柠檬酸盐等）结合了这些离 子后，可使细胞间的桥粒联接断开，有利于细胞分离。但单独使用鳌合剂分离细胞效果较差，故常与酶消 化法结合使用以提高细胞获取率。（三）生物方法一酶消化法此法是目前分离获取游离组织细胞的最常用的方法，即利用特定的酶破坏细胞之间的蛋白连接，从而达到 分离细胞的目的。根据不同细胞不同的蛋白连接应选用不同的酶种类，胶原蛋白在高等动物机体中含量丰 富，约占蛋白质总量的1/3,对动物和人体皮肤、血管、骨胳、筋腱、牙齿和软骨的形成等都十分重要，是 这些结缔组织的主要基质。故分离时常用的是胶原酶法。由于胶原酶性质较温和，故该法对细胞膜损伤小， 且细胞分离彻底，故获取率、活率均较高。由于胶原蛋白有很多种类型，1型、II型、田型、IV型等，其对应消化的酶也各有不同的型。位于基底膜 的第IV型胶原蛋白是维持细胞养分和其它正常代谢的重要关键，故破坏此种蛋白一般即可达到细胞的分 离。此外，V型胶原酶消化时间不宜超过10min，否则细胞活率反而下降，可能是其消化效率较高的原因。 由于胶原酶成本较高，可采取循环灌注及二步灌注以减少酶用量2。一般操作如下：术前打开台上的照明 灯，以保证分离过程中温度恒定于37C。将动物组织灌以前灌注液（一定浓度的EDTA/EGTA溶液，或 D-Hanks溶液，或胶原酶溶液，预先在37C水浴箱中预热），待组织变成黄白色（血细胞等基本除尽）后， 用胶原酶溶液缓慢灌入，溶液可以重复使用，每次使用前均应在37 C水浴箱中预热以保持酶活力。待组织 韧性消失，压迫不易恢复，将其取下放入平皿中，用眼科镊剪去除组织管道系统，然后连同灌注流出的胶 原酶溶液放入锥形瓶中，在37C水浴箱中振荡消化，再用培养液终止反应制成细胞悬液。酶消化法不仅对细胞机械损伤较小，获得的细胞纯度高、数量多、形态易于观察，还能较完整地保存膜蛋 白，保留细胞的各种功能，且能维持较长时间。但此法操作环节多，条件严格，技术要求高，所费时间长， 易污染，分离获取的细胞产量不如直接分离法高，且背景常有细小碎片等杂质，而且酶制剂多价格昂贵， 不经济。二、细胞的分离纯化获得了细胞悬液后，还须对其中夹杂的各种细胞进行分离和进一步纯化，以得到高纯度的靶细胞。常用的 有贴壁法，离心法（包括差速离心、密度梯度离心）。另外，磁性微载体作为新型的功能材料近来被广泛 研究，它在细胞分离方面也有较好的应用。1. 贴壁筛选法动物细胞一般都是贴壁培养的，利用这一点性质，可以根据细胞悬液中各种不同细胞的不同贴壁性质，即 贴壁的先后、快慢，进行反复贴壁淘汰贴壁慢的细胞以达到分离的效果。如成肌细胞（贴壁慢）与非成肌 细胞的分离即可用此法3。但这种方法效率相对较低，因为动物细胞的贴壁往往需要较长的时间，而且有 些细胞悬液中夹杂的各类细胞的贴壁先后、快慢的界限不易控制，分离可能无法达到理想的效果。2. 差速离心（differential centrifugation ）即在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞（见图1）。由于某些细胞在大 小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降细胞常常被快沉降细胞裹到沉淀块中，一般重复23次效果会好一 些。图1.速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀差速离心一般只用于分离大小悬殊的细胞。此法“分辨率”较低，只可将细胞初步分离，故常需通过密度梯 度离心作进一步分离纯化。3. 密度梯度离心（density gradient centrifugation）本法是一种区带分离法，通过梯度密度来维持重力的稳定性，即用一定的介质在离心管内形成一连续或不 连续的密度梯度，将细胞悬液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。用于分离 活细胞的介质应满足下列条件：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）pH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒，细胞洗涤后能用于体外培养，分离液要无菌或能通过除菌滤膜。 常用的有氯化铯，蔗糖，多聚蔗糖等。这类分离又可分为速度沉降和密度沉降两种（见图2）。 速度沉降（velocity sedimentation）速度沉降主要用于分离密度相近而大小不等的细胞。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密 度应小于被分离细胞的最小密度。细胞在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降 而达到分离。 密度沉降（isopycnic sedimentation）密度沉降适用于分离密度不等的颗粒。细胞在（非）连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间沉降 或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞分离。密度沉降通常在较高密度的介质中进行，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度 要求有较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需要的力场通常比速度沉降法大10100倍，故往往 需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利，故本法对细胞有一定 的损伤，大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤，停留在等密度介质中的细胞比处在移动中的细胞受到更 大的损伤。图2. （A）速度沉降（B）密度沉降现在各种细胞分离试验中应用较多的密度梯度法是Percoll非连续性密度梯度法4，5。Percoll是一种经 聚乙烯毗喀烷酮（PVP）处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。如分离外周血单个核细胞时，利用Percoll液经高 速离心后形成一个连续密度梯度，可将密度不等的细胞分离纯化，获得较好的效果（见图3）。但该法操作流程较长，手续较多。也有用Ficoll-Paque （葡萄糖-泛影 葡胺）法进行密度梯度分离的，但有报道称其效果略逊于Percoll法。此外，一种新型的无离子含碘化合物一一碘六醇也可作为细胞分离液。碘六醇能溶解于水，惰性强、粘滞 性小，无细胞毒性，分离范围广69，且能高压消毒，分离各类细胞操作简便、细胞纯度高、活力强， 适用于各种细胞免疫学和形态学的研究，为一种理想的细胞分离液。常用的是等渗的不连续密度梯度法， 使用时碘六醇一般用TGD （含0.1%明胶，0.003 %脱氧核糖酸的台氏液）配置成各梯度液。图3. Percoll连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图4. 流式细胞术（Flow CytoMeter, FCM）此法是通过分离含有单细胞的液滴而实现的，在流式细胞仪的流动室的喷口上有一个超高频电晶体，充电 后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴（鞘液），待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以 正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器 中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离（见图4）。该法与传统的荧光镜检查相 比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，分离纯度较高，可达99%，但所需的流式细胞仪价格昂贵（50 150 万）。5. 细胞电泳法在一定pH值条件下，细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细 胞电泳（cell electrophoresis）。不同细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同，利用这一 点可用来分离不同种类的细胞，例如淋巴样细胞与造血细胞的分离。但细胞和细胞培养液在电场作用下加热时，易产生对流和沉淀，所以，当重力大于电场力的时 候，沉淀起主要作用，而当电场力大于重力时，对流起主要作用，这样原来已经分离的成分就会重新聚合 在一起，使分离效果大大降低。据报道，此法在太空中（排除了重力干扰）分离提取细胞及其它目的组分 时效果较好。6. 磁性活化细胞分选（magnetic activated cell sorting，MACS） 10MACS即在不溶性磁性微载体表面接上具有生物活性的吸附剂或其它配体（如抗体、荧光物质、外源凝结 素等）活性物质，利用它们与指定细胞的特异性结合，在外加磁场的作用下可将细胞分离、分类以及对其 种类、数量分布进行研究。现在应用较多的是免疫磁珠法11， 图4,用流式细胞计分离细胞即在磁珠表面包被上抗细胞表面的特异性抗体，然后将该磁珠与细胞悬液混合，磁珠通过表面的抗体捕获 相应的细胞，两者在通过外加磁场时发生偏转而达到分离的目的（见图5）。此法操作简单，快速，样本 量可大可小，易在无菌条件下操作，并可获得高纯化率活性细胞。有时还可与密度梯度离心法联合应用， 以取得更好的分离效果12。磁性微载体直径的大小将影响其与细胞结合的程度。一般的免疫磁珠法采用的磁珠颗粒较大（直径0.5“m），与细胞结合后抑制细胞活力，仅用于去除磁珠标记的阳性细胞，即阴性选择（也称反相分离）， 无法通过阳性选择（也称正相分离）获得活力良好的细胞群11。如利用一种微小磁珠（直径 50 nm ）建立 免疫磁珠细胞分离法，不仅可通过阴性选择分离细胞，还能用于阳性选择，得到具有良好活力的阳性细胞。 与其他细胞分离技术比较，此法的优点有：颗粒很小，与细胞结合后，一般不影响细胞活力，分离的细胞能用于后续实验；磁性颗粒只 在电镜下可见，不改变标记细胞的光学性质，可借助荧光显微镜或流式细胞仪监测分离效果；磁性颗粒 可用过滤方法除菌。临床和实验研究中，可根据需要选择不同分离容量的分离柱，在较短时间内分离到高质量、足够数量的阳性细胞。对分离含量极微的细胞亚群，将这 种方法与FACS （荧光激活的细胞分离技术）技术结合，可望提高细胞分离效果。Morris12等采用正相分离的方法对朗氏表皮细胞进行纯化。Flf13等利用包被着抗淋巴细胞抗体的磁 微球对人类单核细胞进行了反相分离。Kato14等利用磁微球从人体外周血中分离出造血细胞CD34+。此 外，磁场强度的高低也会影响纯化细胞的产率。图5.免疫磁珠法的细胞标记、分离原理7. 显微切割技术（microdissection technique）有时，我们需要收集分离组织内的单个细胞，但常规手段往往不易做到，而显微切割技术可以很好地解决 这个问题，而且能大大削弱组织中异质细胞的混淆作用，因而受到高度重视并得以广泛应用15,16。 此法不必预先制备细胞悬液，它是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、 细胞群、细胞、甚至细胞内组分或染色体区带等）进行切割分离并收集的技术。其方法大致有4种：手动 直接显微切割，机械辅助显微切割，液压控制显微切割，激光捕获显微切割。手动直接显微切割是早期的切割方式，它是直接在显微镜下手持切割用针分离组织或细胞群，此种方式切 割精度低，只适用于对较大块组织中的局部区域或细胞群进行分离，切割单个细胞十分困难。机械辅助显微切割是利用普通光学显微镜的微调旋钮控制切割针切割细胞，可采用30G1/2注射用针替代 需要专用拉丝设备制作的玻璃切割针。此方式切割精度较手动直接显微切割的精度有了提高，可以达到对 较大的单个细胞的切割，而且简单易行，低耗，尤其适合于基层和无专用设备的单位。但由于显微镜的微 调旋钮只能进行二微控制，对切割后的细胞进行收集较为困难，且切割精度仍然较低。液压控制显微切割是采用液压式显微操纵系统配合倒置显微镜进行显微切割，目前常用的操纵系统有日本 的Narishige和德国的Eppendorf液压显微操纵系统，该系统同时可用在转基因动物及显微注射等实验中， 它通过液压系统可提供X轴、Y轴和Z轴三个方向的精确的三微控制，其切割精度是目前各种方式中最高 的，也是很多实验室常用的方法，其不足是不能实现显微切割的自动化，要收集较大量的目的组分时耗时 长，效率低。激光捕获显微切割17, 18 (Laser Capture Microdissection, LCM)是目前最为先进的方式，由美国国立 健康研究院肿瘤研究所病理研究室与生物医学设备组合作研发，将系统发展为Acturus的PixCell II系统。 在操作这套系统时，首先在组织切片上覆盖一层透明的膜，在显微镜下观察该组织切片，选择某一特殊细 胞后，开启脉冲式红外激光束，使膜融化变得粘性很强(该膜的成份为Ethylene Vinyl Acetate Polymer， 醋酸乙烯聚合物)，等到冷却后将该位置的细胞牢固地粘附在上面从而分离细胞。该种方法较以往方法改进 之处是：简单，不需要移动任何切片部位，一步即可完成从组织中分离特殊细胞，这些在膜上的细胞依 然保持其原有的形态，使用无菌、一次性的膜可最大限度地避免可能的污染。使膜活化所需的激光能量 很小(50mW)，与常规显微配合是充足的，完全能够满足临床病理组织细胞显微分离的需要。(3LCM技术 分离细胞速度较以往方法有很大提高，手工分离方法远远不能达到该速度。由于组织切片固定，操作者可 以反过来确定所分离的细胞是正确的靶细胞。而手工机械显微分离可能会引起周围其它细胞一块松动，污 染靶细胞。此法快速方便，可从大量的研究材料中迅速捕获较多的目的组分，自动化程度高，但往往需要 昂贵的专用设备。参考文献1. 吴喜贵，许霖水.肝细胞的直接分离与培养.第三军医大学学报，1996,18(3):1692. 孙海晨，李铎，刘爽，孙家邦.改良原位二部法门脉胶原酶灌注分离单肝细胞.首都医科大学学报， 1998, 19:653. 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