同工酶实验宁波大学

垂直电泳分离同工酶 （活性染色鉴定法） 实验目的 ： 理解同工酶的概念及遗传学意义 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术 掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色 1. 同工酶 是指能够催化相同的化学反应，但酶 分子结构、理化特性乃至免疫学性质不同的一 组酶。 它们是由遗传体系决定的在不同组织中 表达的蛋白质作用相同 ,但分子结构、理化特性 等不同 . 2. 由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的不同， 在电泳时条带略有差异 ,因此可用电泳将它们分 离开来。 3. 本实验做的是乳酸脱氢酶的分离鉴定 乳酸脱氢酶 用电泳方法将 LDH同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎动物各组 织中有五条酶带。每条酶带的酶蛋白都是由四条肽链组成的四聚 体， LDH有两类肽链， A（ M）或 B（ H），各有不同 同工酶的 免疫性质，按排列组合可形成符合于电泳酶带数的五种同工酶。 LDH1及 LDH5分别由纯粹的 4条 B链（ B4）和 4条 A链（ A4）形 成，称为纯聚体；而 LDH2、 LDH3和 LDH4都是由两类肽链杂交 而成的，分别可写成 AB3、 A2B2、 A3B，称为杂交体 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理 净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对 天然状态生物大分子进行的电泳，利 用蛋白质分子中所带净电荷、分子质 量、形状的差异，而在电场中泳动的 速度和方向不同，达到分离的目的。 实验器材 ： 夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳 压电源（电压 300-600V， 电流 50- 100mA），移液枪（各种量程），烧杯 （ 100mL），培养皿 , 实验流程 试剂的配制 仪器的准备 动物组织的样品的获取 分离胶（ 30分钟） 浓缩胶（ 30分钟） 电泳（ 2-3小时） 染色（ 30分钟） 观察结果 一 、 试剂： 1.凝胶储备液： 储备液： pH8.9 TrisHCl缓冲液： 1 M HCl 48ml， 36.6g Tris，加双蒸水到 80ml，调节 pH到 8.9定容到 100ml。 储备液 ： pH6.7 TrisHCl缓冲液： 1 M HCl 48ml， 5.98g Tris，加双蒸水到 80ml，调节 pH到 6.7 定容到 100ml。 储备液： 分离胶储备液（ 30% Acr/Bis）： 30g Acr， 0.8g Bis，用双蒸水定容到 100ml，备用， 4 存放可以保存 1个月。 储备液： 浓缩胶储备液： 10g Acr， 2.5g Bis，用双蒸水定容到 100ml，备用， 4 可以保存 1个月。 储备液： 10% Aps（ W/V）： 1g定容到 10ml， -20 保存。 储备液： 40%蔗糖： 40g蔗糖溶解到 60ml双蒸水中。 TEMED 2.电泳缓冲液： Tris6.0g， 28.8gGly 加双蒸水到 900ml调节 pH到 8.3，定容到 1000ml，使用时稀释 10倍。 样品制备 取材： 大黄鱼若干条，解剖取 1.肠、 2.眼睛、 3.鳃、 4.肌 肉、 5.脾、 6.鳍、 7.肝、 8.心脏 放入冰箱保存。 提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液 Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需 预冷，组织重量（ g）与缓冲液体积（ mL）之 比为： 5,用研钵研磨充分。浆液 离心约分钟， 转分钟。 取上清液至新管，吸取其中 150ul样品，加 ul 甘油 和 ul溴酚蓝，混匀之后即可点样。 分离胶的制备 将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放置备 用。取一 100ml烧杯，按表比例混匀之后 使用。 储备液 A储备液 C储备液 E储备液 双蒸水 TEMED 总体积 用量（ ml） 2.5 3.75 0.1 13.75 10ul 20 配方表 浓缩胶的制备 TEMED最后一个加入，轻轻混匀。移液枪吸取加入约 2.0CM左右高度 的浓缩胶液，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。当浓缩胶上出现水 层后表明聚合完成。再放置 30 60min后可以使用。 加入少量电泳缓冲液，小心拔出样品梳（两端同时向外拔），再注满缓 冲液备用。 储备液 B储备 液 D储备 液 E储备 液 F储备 液 双蒸水 TEMED 总体积 用量 （ ml） 1.25 0.8 60ul 5 2.9 16ul 10 配方表 点样 加样 样品迁 移方向 电 泳 电压和电流：浓缩胶电压 100v，分离胶电压 180V. 电流流 18 30mA 溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。大约 2-3个小时 夹在两块玻璃 板之间的凝胶 电泳 缓冲液 电泳 缓冲液 加在槽中的样品 分子量小 分子量大 电源 电 泳 示 意 图 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分 子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。 混合样品 带孔胶 按分子 大小分离 电泳方向 电泳 小分子 大分子 乳酸脱氢酶染色剂的配制 乳酸钠 0.5ml NAD 25mg PMS 2mg NBT 15mg 0. 2M Tris Hcl溶液（ PH8.0） 10ml 去离子水定容至 50ml 染色与观察 将胶从中间切成 2块，各自切去一个小 角（作为标记），去离子水轻轻从玻 璃板上吹下， 置于大培养皿中，去离子水浸洗之后 倒入染 染色剂浸没，避光于 37度摇床中染色 30min。 观察拍照 思考题： 根据实验过程的体会，总结如何做好 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是 关键步骤？哪些过程中是 为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和 甘油溶液？分别有何用途？ 谢谢