不同游泳形式运动对衰老小鼠模型骨骼肌线粒体DNA缺失的影响

不同游泳形式运动对衰老小鼠模型骨骼肌线粒体DNA缺失的影响 目的 研究不同形式运动对衰老小鼠模型骨骼肌线粒体DNA(mtDNA)的影响。方法 用D半乳糖诱导衰老模型小鼠，以不同形式运动方式训练小鼠6 w后检测腓肠肌组织SOD活性、MDA含量和mtDNA的缺失比例。结果 运动各组与无运动组相比小鼠腓肠肌组织SOD活性显著提高(P运动训练;D半乳糖;线粒体DNA;衰老伴随衰老出现的运动和活动能力的下降是衰老的重要表现之一，这种运动系统形态和功能的退行性改变是一个很复杂的过程。骨骼肌是人体最大的组织构件，也是决定人体运动能力最重要的结构，其衰老机制的研究，对于增强老年人的运动系统的功能，提高生活质量有着重要的意义。为了解不同形式运动对衰老骨骼肌形态及抗氧化能力的影响，本研究观察不同形式运动对mtDNA缺失的影响，为延缓衰老，提高老年人口的生活质量，进行科学运动干预提供科学的方法与理论依据。1 材料与方法1.1 实验动物 雌性昆明种小鼠，8月龄，体重5060 g，共40只，由湖北省疾控中心实验动物中心提供。随机分为对照组(CS组)，模型组(CD组)各5只。无负荷游泳组(WN组)，负荷游泳组(WR组)，组合游泳组(WS组)各10只。1.2 实验方法 常规适应性喂养1 w后开始运动。D半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老动物模型，D半乳糖(武汉奥普生化有限公司)用生理盐水配成5%的溶液，按100 mgkg-1d-1注射1次，连续6 w1。运动条件：塑料大桶，内壁光滑，直径50 cm，水深40 cm，超过小鼠身长2倍，水温3234。运动方式：无负重游泳、负重游泳、两种游泳方式交替。运动方案：对照组不运动;实验组前3 d适应性训练10 min，1 w内延长至20 min，1次/d，每周6 d，共6 w。负重的方式为尾部负重，重量为体重的5%。组合运动组采取隔天更换运动方式的方案。运动形式：运动5 min，间歇5 min。1.3 取材 戊巴比妥钠(65 mg/kg)麻醉，冰浴下(冰盘)剪开后肢皮肤，暴露小鼠后肢肌肉，取同侧比目鱼肌、腓肠肌，称重，去除多余的脂肪和结缔组织，装入1 ml离心管中，置入-70冰箱待测。1.4 主要试剂和仪器 SOD、MDA测试盒(南京建成生物有限公司)、DNA抽提纯化试剂盒(杭州维特洁生化技术有限公司)、Taq DNA 聚合酶(Promega 公司)、EPS300电泳仪、PCR扩增仪 PE2400型、凝胶成像仪FloursTM型。引物P1、P2和P3、P4按参考文献设计2，由上海博亚生物有限公司合成。其中P1 5CGCTCTACCTCACCATCTCTT3(645665 bp)、P2 5TGCTTACCTTGTTACGACTT3(999979 bp)扩增正常mtDNA，P3 5ACCAACAGCTACCATTACATT3(8 4848 504 bp)、P4 5TGATTGGGTTTATGAGGTCTG3(13 09813 078 bp)扩增缺失mtDNA。1.5 抗氧化物酶的测定 采用黄嘌呤氧化酶法，依SOD试剂盒说明操作检测超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用硫代巴比妥酸比色法，依丙二醛(MDA)试剂盒说明操作检测MDA。1.6 mtDNA缺失的检测 mtDNA提取：采用差速离心法提取组织中的线粒体。将组织块剪碎，浸入预冷匀浆介质(10 mmol/L EDTA，0.05%牛血清蛋白，pH6.8，04)中匀浆，匀浆液在2,2 480 r/min离心10 min,取上清液,再经2 300 r/min离心15 min,去上清液,沉淀用匀浆介质(10 mmol/L KCl，0.1 mmol/L EDTA，0.05%牛血清白蛋白)中悬浮。再用9 300 r/min离心10 min,去上清液后用匀浆介质将所得沉淀即线粒体稀释成3 g/ml。再按DNA抽提试剂盒操作说明从线粒体中分别提取mtDNA。PCR扩增：以提取的mtDNA为模板，分别对各组mtDNA样本进行片段扩增。50 l反应系统中含模板DNA 50 ng，引物浓度各为100 pmol/L，4dNTP各200 mol/L,加入10缓冲液2.5 l,加入Taq DNA聚合酶1.5 U,灭菌蒸馏水补足至25 l。扩增条件为95预变性4 min，94变性30 s，60退火30 s，72延伸30 s,反应30个循环,末次5 min延伸。PCR产物定量：PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像仪扫描成像;运用凝胶成像仪中Quantity One分析软件取得各条带的积分光密度，其中354 bp条带的积分光密度值代表无缺失mtDNA的含量，而748 bp条带的积分光密度值代表缺失mtDNA的含量，用以计算缺失mtDNA占总mtDNA的百分比值。1.7 统计学处理 数据以xs表示，用SPSS13.0软件包进行方差分析。