基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析小分子化合物

MALDI-TOF MS分析小分子化合物新方法对于分子量小于400Da的化合物，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间 质谱（MALDI-TOF MS）的常规方法难以检测，这主要是由于小分子基质带 来的干扰。为此，本方法发展了一种MALDI-TOF MS分析小分子的新策略， 将小分子转移到高质量区域测定，成功的分析了赤霉酸等一系列小分子化合 物。1实验部分Bruker公司AUTOFLEX III MALDI-TOF质谱仪，氮分子激光，波长355nm， 使用前用混合多肽（购自Bruker公司，包括：血管紧张肽I,血管紧张肽II, P物 质，蛙皮素，促肾上腺皮质激素1-17,促肾上腺皮质激素18-39,生长激素释放抑 制激素28）外标法校正仪器。金属酞箐化合物的合成参照已发表的文献，最终产物经过紫外可见吸收光谱 （UV-Vis），质谱（MALDI-TOF MS）以及核磁（NMR）表征。样品和基质分别溶于适当溶剂，二者按照一定比例混合均匀，取川1混合溶 液滴在MALDI样品靶上，或者直接吸取川1样品溶液滴在靶上，待溶剂自然挥 发样品结晶后，送入质谱仪，进行质谱分析。实验中数据采集时所用参数如下： 加速电压19kV，反射模式，激光频率10Hz，使用最大激光能量的40-90%，累 加 30-200 次。使用 Bruker 公司的 XMASS 软件，flexControl 和 flexAnaysis 软件 进行数据采集和数据处理。2结果与讨论2. 1金属猷警基质的发现酞箐化合物是一类具有n电子共轭结构的大环化合物，具有良好的热稳定性 和化学稳定性一直被广泛用作染料，此外，由于其独特的光、电、磁及对某些气 体的敏感性等方面的特性而被应用于化学传感器、非线性光学材料、光盘信息记 录材料、太阳能电池材料、燃料电池中的电催化材料、场效应晶体管、气体检测 及光动力学治疗癌症等许多方面。在用MALDI-TOF MS分析金属酞箐类化合物时，由于该类化合物在紫外可 见区有吸收，可以吸收激光（波长337nm）能量，所以，在没有基质的情况下能 够解吸电离得到分子离子峰。当使用常规基质，如必氤基-4-羟基肉桂酸（CHCA） 和2, 5-二羟基苯甲酸（DHB）时，三价金属酞箐化合物对基质分子有加合作用， 而二价和四价金属酞箐化合物与基质分子没有加合作用。因此，利用三价金属酞 箐化合物用于分析小分子，它可以将小分子从低质量区域转移到不受干扰的高质 量区域，从而消除传统基质带来的干扰。2. 2无基质时MALDI-TOF MS分析金属猷箐化合物编号MR缩写准确质量摩尔分子量1A13+HaC(aPc)Al(aPc)+827.3608827.92692Ga3+Ga(aPc)+869.3048870.66833In3+In(aPc)+915.2831915.76334A13+(pPc)Al(pPc)+1131.48601132.31075Ga3+Ga(pPc)+1173.43001175.05226In3+In(pPc)+1219.40831220.14727Mg2+I，。Mg(hPc)968.2193969.20708Zn2+(hPc)Zn(hPc)1008.16341010.31209SnONon(Pc)SnO(Pc)648.0469647.232410SnF2SnF2(Pc)670.0488669.229911TiOTiO(Pc)576.0926576.3894图1金属酞箐化合物(MPcs)的结构引740/1ecnabrosuuA020502300350400450500Wavelength(nm)200250300350400450500Wavelength(nm)ecnaorosoA300350400450500Wavelength(nm)200250300350400450500Wavelength(nm)图2紫外-可见吸收光谱(A)金属酞箐化合物2 (B)金属酞箐化合物7(C)基质 CHCA (D)基质 DHB金属酞箐化合物(结构见图1所示)有Q带和B带两个吸收带，这是n-n* 跃迁引起的。MALDI-TOF MS所用激光波长为337nm，此波长刚好位于金属酞 箐化合物B带吸收带内，图2 A是酞箐化合物2在200-500nm波段的紫外可见 吸收光谱，它在324nm处有较高的吸收；图2 B是酞箐化合物7在此波段的吸 收光谱，它在340nm处有较高的吸收。MALDI-TOF MS所用的基质CHCA和 DHB能够吸收激光能量，其紫外可见吸收光谱见图2 C和D。金属酞箐化合物 的吸收峰和两个基质的吸收有很大相似之处，不同的是前者的吸收峰比较宽而后 者较窄，吸收峰值不完全相同，CHCA和DHB的吸收峰值分别是340nm和 339nm，更接近激光波长。金属酞箐化合物能吸收激光能量，理论上在不加基质 的情况下它能直接解吸电离产生分子离子峰。图3为不加基质情况下酞箐化合物 2的质谱图及实验所得同位素分布与理论同位素分布的对比。从对比中看到，二 者十分吻合。866868870872874876878(B)图3无基质情况下酞箐化合物2的质谱图(A)及理论与实际同位素分布的对比(B)2. 3使用常规基质时MALDI-TOF MS分析金属酞箐化合物表2使用CHCA和DHB为基质分析金属猷警化合物的MALDI结果基质编号Mass , cal.MaSSdet.1827.41016.52869.31058.43915.31104.441131.51320.651173.41362.5CHCA61219.41408.57968.2968.281008.21008.29648.0648.010670.0670.011576.1576.11827.4981.52869.31023.43915.31069.441131.51285.651173.41327.5DHB61219.41373.57968.2968.281008.21008.29648.0648.010670.0670.011576.1576.1(B)1experimentaltheoretical1056105910621065图4以CHCA为基质时（A）金属酞箐化合物2的质谱图以及（B）实际与理论同位素分布的对比使用CHCA和DHB作为基质，用MALDI-TOF MS对一系列金属酞箐化合 物进行分析，所得质谱结果见表2。其中，三价金属酞箐化合物1-6，检测得到 的分子量比理论计算值大。以化合物2为例，当以CHCA为基质时（其质谱图 见图4 A），检测得到的质荷比（m/z）为1058.4，而理论值为869.3。用检测值 减去理论计算值得到的值是189.1，相当于CHCA的分子量。经过计算发现，其 余五个化合物也是这种情况。因此认为，化合物1-6在检测的过程中与CHCA 的分子发生了加合作用，且二者比例是1:1。用XMASS对化合物2与CHCA 加合物M+CHCA+的同位素进行模拟，与实验得到的同位素分布相比较（见 图4 B),二者吻合得很好。实际上化合物1-6是酞箐阳离子，带一个正电荷M+, 当它与中性的CHCA分子结合后形成M+CHCA+带一个正电荷。而当以DHB 为基质时，化合物1-6与DHB的分子发生了加合作用，二者的比例是1:1。从表 2中，还可以看到，对于金属酞箐化合物7-11，包括二价金属酞箐和四价金属酞 箐，检测得到的分子量与理论计算值相符。基于以上的结果，可以大胆地设想：三价金属酞箐作为MALDI MS新基质 分析小分子化合物，利用它与小分子的加合作用将小分子从低质量区域转移到高 质量区域，就能解决MALDI-TOF MS无法分析赤霉素等小分子样品(400Da) 的难题。2. 4金属猷警用作MALDI基质分析小分子的新策略从理论上讲，金属酞箐分子(结构见图1所示)具有进一步和含氧等配位原 子或含大兀键等分子形成络合物或加合物的潜力，它们能和小分子有机物等形 成加合物，其质谱峰出现在1000Da以上的信号区域，如图5所示。图5 A表示MALDI-TOF MS正离子模式下分析柠檬酸，使用传统基质 CHCA，只能在小于500Da的质量范围内产生杂乱的谱图，很难找到样品的分子 离子峰，当使用铝酞箐AlPc基质，柠檬酸以加合物Al(pPc)(citric acid)+的形 式在较高的质量范围检测到，信号强，分辨率高。此外，还能观察到Al(pPc)+， 可作内标或参考，用于分子量的精确测定。AlPc基质可用于更多小分子样品的 分析，见表3。co200016M12003004000Ai（p?c）r113 3.4060AIpPcXCItric Acid）*1323.5132CHCA maLrix Al Pc fnatrixWOO 15000m/zm/z图5使用铝酞箐基质与CHCA基质的对比（A）在正离子模式下分析柠檬酸（B）在负离子模式下分析硬脂酸表3使用铝酞箐作基质时MALDI分析结果，使用正离子模式，分析物/基质摩尔比为5:1b MHAMAl(pPc)HAMAl(pPc)MAl(pPc)HA-1131.4860.样品HA分子式MAl(pPc)HA aMHAbMha误差/ppma-cyano-4-hydroxycinnmaic acidC10H7NO31320.5295189.0435189.042652, 5-dihydroxy benzoic acidC7H6O41285.5131154.0271154.02663salicylic acidC7H6O31269.5170138.0310138.0317-5citric acidC6H8O71323.5132192.0272192.02701gibberellic acidC19H22O61477.6291346.1431346.141641,2,3,4-tetrahydro-9-acridano-neC13H13NO1330.5847199.0987199.0997-5a MAl(pPc)HA=mass of Al(pPc),HA+.c M，ha = theoretical mass of HA.在负离子模式下(图5 B)，使用传统基质CHCA分析硬脂酸，能看到很强的 与基质相关的离子：188.0 (M-H-)，399.1 (2M-2H+Na-)，但是，使用铝酞箐 AlPc基质，硬脂酸以Al(pPc)(stearic acid - H)-离子的形式检测到。此时也能观 察到Al(pPc)-，但是信号很弱。该方法能用于分析赤霉酸(GA3)，还可以分析 氨基酸、小肽、脂肪酸、黄酮等小分子样品，见表4表4使用铝酞箐作基质时MALDI分析结果，使用负离子模式，分析物/基质摩尔比为5:1样品HA分子式MAl(pPc)A &MHAbM，haca-cyano-4-hydroxycinnmaic acidC10H7NO31319.5189.0189.02, 5-dihydroxy benzoic acidC7H6O1284.5154.0154.0salicylic acidC7H6O31268.5138.0138.0citric acidC6H8O71322.5192.0192.0Vitamin CC6H8O61306.5176.0176.0Vitamin ppC6H5NO21253.5123.0123.0gibberellic acidEQ1476.6346.1346.1cholic acidC24H40O51538.8408.3408.3PheC9H11NO21295.6165.1165.1LysC6H14N2O21276.6146.1146.1CysC3H7NO2S1251.5121.0121.0Phe-PheC18H20N2O31442.6312.1312.1Asp-PheC13H16N2O51410.6280.1280.1luteolinC15H10O61416.5286.0286.0quercetinC15H10O71432.5302.0302.0palmitic acidC16H32O21386.7256.2256.2stearic acidC18H36O21414.8284.3284.3样品HA分子式MAl(pPc)A &MHAbM，HAc4,4-(3,6-diethynyl-9H-fluorene-9,9-diyl) diphenolC29H18O21528.6398.1398.14- ter-butylphenolC10H14O1280.6150.1150.12-methyl-1,3,4,10-trtrahydro-9(2H)-acridinoneC14H15NO1343.6213.1213.11,2,3,4-tetrahydro-9-acridanoneC13H13NO1329.6199.1199.1norharmaneC11H8N21298.6168.1168.1a MAl(pP6A = mass of A1(pPc)，A-.b MHA= MAgA - MA1(pPc) + MH= MAi(pPc)A-1131.5 + LO = MA1(pPc).A-1130.5.c Mha = theoretical mass of HA.2. 5样品分子量的计算在新方法中，所看到的质谱峰不是样品本身的分子离子峰，而是加合物的峰, 样品的分子量只要简单的计算就能得到。正离子模式下（图5 A）,样品的分子量为：M(Pc)rau Ga3+ In3+，这和它们形成络合物的能力相一致。因为 Al、Ga、In的价电子结构分别为3s23p1、3d104s24p1、4d105s25p1，轨道杂化以后 可以形成3、4、6配位化合物。事实上，它们可能与酞箐环的四个配位氮原子形 成了四面体配位结构，当与有配位能力的小分子样品相遇时，可能会全部或部分 转变成八面体配位结构(图7所示)，从而出现了观测到的质谱峰。图7 A表示 的是金属酞箐和样品分子之间可能发生的反应。图7 B表示的是八面体配位 MPcAHA结构和最可能的离子化路线。DIPs%+ HA*MPcA + HAMPc*HA+AH.V+ MPc+AJMPc+ + A+ HAMPc + HA+ + Ac，MPc* 4- HA +A+HA+HAMPc-A-HApiPr】-MPc AMPcHAf + A图7 (A)金属酞箐和样品分子之间可能发生的反应；(B)八面体配位MPcAHA最可能的离子化路线图8混合物样品的MALDI谱图使用铝酞箐作基质(A)正离子模式下(B)负离子模式下，各个峰对应：(a)水杨酸(pKa=2.97) (b) 4-叔丁基苯酚(pKa=10.39) (c)咔琳(pKa=14.9) (d)棕榈酸(pKa=9.7) (e)硬脂酸(pKa=10.15) (f)吲噪(pKa=16.2,未检测到)除了基质本身，样品的pKa值也会影响质谱信号。检测了六种不同pKa的等 摩尔的混合物，结果见图8,谱图没有吲噪的目标离子峰，说明它可能没有与基 质发生加合作用。从图中可以看到，目标信号随着样品酸性的增强(pKa值减小) 而增强，这表明在基质一样品络合物形成中，静电作用很重要。由于质谱信号强度受到上述很多因素的影响，新方法的灵敏度也会随基质与 样品的不同而有所变化，使用铝酞箐基质Al(pPc)分析CHCA (pKa =1.2)的检测 限为 17fmol。