第一法大肠菌群MPN计数

第一法大肠菌群 MPN 计数操作步骤6.1、样品的稀释6.1.1、固体和半固体样品：称取 25g 样品，放人盛有 225ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8OOor/min-10OOOr/min 均质 1min-2min，或放人盛有 225ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1min-2min，制成 1:10 的样品匀液。6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取 25ml 样品，置盛有 225ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成 1:10 的样品匀液。6.1.3、样品匀液的 pH 值应在 6.5-7.5 之间，必要时分别用 1mol/L 氢氧化钠（NaOH）或 1mol/L 盐酸（HCI）调节。6.1.4、用 1ml 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1ml,沿管壁缓缓注人 9ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1ml 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。6.1.5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成 10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1次，换用 1 支 1ml 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15min。6.2、初发酵试验每个样品，选择 3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种 3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种 1ml（如接种量超过 1ml，则用双料 LST 肉汤），36C1C 培养24hZh，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至 48h2h。记录在 24h 和 48h 内产气的 LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。6.3、复发酵试验用接种环从所有 48h2h 内发酵产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 l 环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36C1C 培养 48h2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.4、大肠菌群最可能数（MPN）的报告根据大肠菌群阳性管数，检索 MPN 表（见附录 B），报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的 MPN 值。第二法大肠菌群平板计数8、操作步骤8.1、样品的稀释按 6.1 进行。8.2、平板计数8.2.1、选取 2 个3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿 lml。同时分别取 lml 生理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。8.2.2、及时将 15mL-20ml 冷至 46C 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加 3mL-4mlVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于 36ClC 培养 18h-24h。8.3、平板菌落数的选择选取菌落数在 30-150 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5mm 或更大。8.4、证实试验从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36C1C 培养 24h-48h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。8.5、大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以 8.3 中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。第三法大肠菌群 PetrifilmTM 测试片法10、操作步骤 10.1 样品的稀释按 6.1 进行。10.2、测定10.2.1、样品接种及培养将待检样品选取 2 个-3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两张测试片。将 PetrifilmTM 大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取 1ml 样液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下,避免气泡产生和上层膜直接落下。把压板（平面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少 1min 以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过 20 片，36C1C 培养 24h2h。10.2.2、判读培养 24hZh 后应立即计数，可目测或用标准菌落计数器、放大镜或 PetrifilmTM 自动判读仪来计数。红色有气泡的菌落确认为大肠菌群。圆形培养区边缘上及边缘以外的菌落不作计数。当培养区域出现大量气泡，大量不明显小菌落或培养区呈暗红色三种情况，表明大肠菌群的浓度较高，需要进一步稀释样品以获得更准确的读数。10.3、大肠菌群测试片计数的报告选取菌落数在 15-150 之间的测试片，计数其红色有气泡的菌落数，两个测试片的平均菌落数乘以稀释倍数即为每克（或毫升）样品中的大肠菌群菌落形成单位（CFU）数。如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15，则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告；如果最高稀释度的菌落数大于 150，计数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于 150 的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以 20 即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为 20cm2,）。报告单位以 CFU/g（或 CFU/mL）表示。