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第一节 概念这里想明确两个概念,一个是Transwell,另一个是肿瘤细胞侵袭模型。1Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思,well有小室的意思,可以从字面上理解,这是一类有通透性 的杯状的装置,根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍,可以认为这是一种膜滤器(Membrane filters ),也可认为是一种有通透性的支架(permeable supports )。更准确地说,Transwell应该是一种实验技术这项技术的主要材料是Transwell小室Transwell chamber, Transwell insert),其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,不同厂家对Transwell会有不同的命名,而 不同型号也可有不同形状,不同大小,根据实验需要,可有不同选择。但无论是何种外形,其关键部分都是一致的,那就是杯子底层的一张有通透性的膜,而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔,孑b径大小有0.1-12.0pm,根据不同需要可用不同材料,一般 常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane )。下图是一个Transwell装置的纵切面 Fig2寺;Il i椅 f|!i pI yc i e e:e pbt iiT-e将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装上层培养液,下室内盛装 下层培养液,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而 可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。Fig3应用不同孑径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种 方面的研究。下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择,当然不同细胞其体积不同,具 体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验:(1).共培养体系:小于 3.0um 孔径条件下,细胞不会迁徙通过,因此,若研究不涉及细胞运动能力,不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0|im以下孔径。常用0.4、3.0|im。我们实验室用的是0.4pm。Fig4将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。(2).趋化性实验可用 5.0、8.0、12.0pm 膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反映下室成 分对上室细胞的趋化能力。 细胞B对细胞A的趋化作用:将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生 的物质对细胞A的趋化作用。 趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋 化作用。(3) .肿瘤细胞迁移实验常用8.0.12.0pm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分 高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。(4) .肿瘤细胞侵袭实验常用8.0.12.0pm膜,原理与肿瘤细胞迁移实验类似。上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,但与肿瘤细Fig5胞迁移实验不同的是,聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶,用以模仿体内细胞外基质,细胞欲进入下室, 先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs )将基质胶降解,方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映 肿瘤细胞的侵袭能力。第二节 Transwell 侵袭实验我的课题涉及TranswelI侵袭实验和Transwell迁移实验,其他方面的Transwell应用我不太清楚,因此 这里主要谈谈 Transwell 侵袭实验。1实验用品:Fig6 Transwell 小室:多种厂家可提供,论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室,我们实验室用的是Chemicon 公司的ECM550系列,另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介 绍的 Thincert。 这些厂家提供的小室,有的已铺好基质胶,买来就可以用,很方便,但也比较贵,我们实验室用的 Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的,质量很好,但是非常贵,24孔板配套的小室,每 个价格约130元,不推荐给大家。BD也有已包被好的,价格不清楚。Coster和Corning公司生产的 小室,是论坛里比较常用的,好像是要自己铺胶,但据说每个小室成本只有 40 左右,应该比较适合 中国国情。下面是一些战友提供的价格,具体建议大家联系代理商咨询。linanping1979战友提供的价格:coster 的24孑L板的transwell的价格是456元RMB,8|im,用于肿瘤的侵袭实验。iceyxy战友提供的价格: Millipore的8|im的50个1760RMB,0.4|im的2000多,是一次性的。梅林战友提供的BD价格: 240RMB块(6.5um,24 孔,12instert),好像是没胶的。liguofan 说国产的 boyden30 块一个。jjyy 提供的价格是:corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950 人民币不到。平均每个20元不到。Transwell 小室按照公司的要求,都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的 Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶,再用胰酶和75%酒精泡,可以把膜洗得很干净,用 前用紫外里外都照30minsword01战友提供的处理方法:用棉签轻轻擦去胶和反面细胞清水冲洗, 超声清洗,低挡,30min,清水3x5min,蒸馏水3x5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,反 面6h,微波,低火10minx2。因为我买的是铺好胶的,所以没买Matrigel,二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前 的Chemicon ECM550系列,膜很结实,擦不坏,可以反复用很多次,但现在的膜已经改用一种很薄 很脆的材料,一般只能重复用一次,真黑啊!很多战友说 Costar 和 Corning 也是可以重复用的,大 家可以试试。victoh 战 友 对 Millipore 公 司 的 millicell 有 比 较 详 细 的 讲 解 , 链 接 如 下 : 本人没见过,有兴趣的可以自己研究一下。另外,根据论坛战友提供的信息,osmonic公司有专用的膜出售,鼎国生物代理。Transwell小室用 过后,可把原来的膜切下,贴上osmonic公司的膜,这样又可以用了,不过我没用过,有兴趣的可以 试试。maojianwen战友的使用方法:trasnwell小室做一次后,将原来的膜去掉,重新泡酸,泡酒 精,使用前照紫外,然后用女士用指甲油(注意用无色较稀的)将osmonic公司的膜贴上,剪掉多余 的边缘。再照紫外。 上层培养液:上层培养液采用无血清培养基,为维持渗透压,需加入0.05%-0.2% BSA。 细胞:值得注意的是,有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs 的表达,特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况,就盲目进行TranswelI侵袭实 验,可能会造成不必要的浪费,一次Transwel l侵袭实验花钱少则数百,多则数千,并不是笔小数目, 还是小心为妙。另外,为了让实验结果更明显,可先撤血清让细胞饥饿12-24h,再进行实验。 基质胶:常用的是人工重构基底膜材料Matrigel,主要成分为层黏连蛋白和IV型胶原,生产厂家有BD、美国 Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的:Matrigel是BD公司生产的,是一种细胞 外基质,4 度时是液体,在 37 度会逐渐凝固成胶状 ,不可逆。同样的东西在 sigma 叫 ECM。 zhangyong1036战友提供的价格:BD公司的matrigel 1500左右。如果购买的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不需要购买了。 下层培养液:下层常用含5%-10% FBS的培养基具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适当提高FBS 浓度。下层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子,但个人认为,FBS 仍是最合适的。 细胞培养板:常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等,以24孑b最常用。细胞培养 板没什么特殊要求,普通的细胞培养板就可以。但要注意,细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室 相配套。 此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin , FN , Sigma有售),这样做的目的是使穿过 膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原(collagen )或明胶(gelatin )。很多战友认为这不是必须 的,而且我也是不涂的,细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。linanping1979战友认 为,如果培养时间很长(24h),细胞还是会掉到下室里面去,所以有条件的话,最好还是在膜下层 涂上FN。另外,值得一提的是,膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。zhangyong1036战友提供的价格:sigma的fibronectin,价格在1500左右。2步骤2 . 1 Transwell小室制备2.1.1无基质胶Transwell小室制备 包被基底膜:用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4C风干。如果需要在下室面铺FN 的话,可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen )的话,一般配成 0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。 水化基底膜:吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37C, 30min另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80|il (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37C 30min使Matrigel聚合成凝胶。2.1.2有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300川预温的无血清培 养基,室温下静置15 - 30min ,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。2.2 制备细胞悬液 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24h ,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用 PBS 洗 12 遍,用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细 胞密度至1- 10x105,个人认为不要超过5x105具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力是不同的。个人经验,细胞量过多,穿过膜 的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点, 所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为,对照组和处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞 预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组和处理组细胞密度一 致。23 接种细胞 取细胞悬液100 - 200|11加入TranswelI小室,不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量 有不同要求,请参考说明书。24孔板小室一般200川 24孔板下室一般加入500川含FBS或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参 考说明书。这里要特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋 化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小 室放进培养板。 培养细胞:常规培养12 - 48h (主要依癌细胞侵袭能力而定)时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵 袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓 度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细胞,24h内对细胞增殖并无明显抑制,但24h后, 抑制作用就开始出现了。所以,用这个浓度来做Transwell,处理时间也必须限定在24h内,否则一旦药 物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照 组少,究竟是由于侵袭被抑制引起,还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。时间过长不可以,同样,过短也不行,因为细胞内会有一定量的MMPs储存,短时间内可能侵袭能力不会 有太大改变。同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响MMPs表达,到最后释放到培养基中,还需要 一个过程。时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提是这个时间范围内 细胞数目不能有明显变化。另外,我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会聚 集成团,所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张,是正常现象在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后, 膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后1- 2h把培 养板从培养箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生。24 结果统计检测穿过的细胞数有两种方法:241 直接计数法2411 “贴壁”细胞计数 这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。如下图:Fig7通过给细胞染色,可在镜下计数细胞 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色:常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。 个人推荐采用0.1%结晶紫染色,这种方法有如下优势:(1). 不需要固定细胞,直接染色即可。(2). 配制简 单方便。(3).染色后可以用33%醋酸脱色,将结晶紫完全洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上570nm测其 OD值,间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。因为,虽然经过准确的细胞计数, 往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制,可能某一批实验穿过的细胞会特别多,以致细胞成堆,这种情况下 就难以计数了,这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意,染色前要将膜风 干,否则可能会染不上。 细胞计数:我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照,把Transwell小室反过来底朝 上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上,滴 二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保存,但是这样做小室就成了一次性的了,未免有点浪费。取若干个视野计数细胞个数。论坛里一般采用35个视野,也有人用10个,都是随机选取,个人认为这 样选择的视野带有很大的偶然性,也会掺进人为影响,特别是计数视野较少的时候。我选取16个视野, 不是随机选择,而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的 ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。Fig8如图,蓝色部分表示膜的大小,白色圆形表示视野的大小,绿色方形则表示拍照时所能拍下的视野的中心 部分。这样,每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数,这样得到结果是比较客观和准确的。Fig9不同厂家不同型号的小室,膜的面积不尽相同,但个人认为,拍照时还是应当选取固定的位置,并选择尽 可能多的视野。2412 “非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系,有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上,而是掉进下室。如下图:Fig10这种情况我没有遇到过,根据论坛里提供的经验,可以收集下层培养液,用流式细胞仪计数细胞量,也可用细胞计数的方法直接在镜下计数,个人认为MTT应该也是可以用的,有兴趣的可以试试看。241 间接计数法间接计数法主要用于穿过细胞过多,而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法,与常用的MTT实验 是同样的原理。2.4.1.1 MTT 法 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 24孔板中加入500卩1含0.5mg/ml MTT的完全培养基,将小室置于其中,使膜浸没在培养基中,37弋 4h后取出。 24孔板中加入500|il DMSO,将小室置于其中,使膜浸没在DMSO中,振荡10min,使甲臜充分溶 解。取出小室,24孑b板于酶标仪上测OD值。2.4.1.1 荧光试剂检测这类方法一般是与Transwell小室一起出售的,其原理与MTT法类似,是用一种荧光染料染细胞,再将细 胞裂解,检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。2.4.1.1 结晶紫检测上文已说过,这里不再赘述,原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点,就是染色和脱色的过 程并不影响膜上细胞,在脱色后还可重新染色。这里附上我实验中的一些图:上面是用Nikon SMZ1000显微镜配套的数码相机直接对膜下室侧进行拍摄得到的照片,左图是对照组, 中间是1/3 72h IC50的浓度处理组,右图是72h IC50的浓度处理组,接种细胞后同时加入药物,培养 24h,结晶紫染色。随着药物浓度增加,穿过的细胞减少,侵袭力明显受到抑制。这是用正置显微镜拍摄的图,结晶紫染色,进行细胞计数。Fig12Fig11第三节Transwell的其他应用的实验步骤1 . Transwell肿瘤细胞迁移实验过程与Transwell侵袭实验基本一致,不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为,由于没有基质胶的阻挡, 细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快,所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1x105,而迁移 实验的密度是1x106。另外,下层培养液的FBS浓度也可适当下调,我做侵袭实验的浓度是5%,迁移实 验的浓度是2.5%。2 . cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤 做了一段时间的原代细胞培养,把经验拿出来跟大家分享一下吧,请有关战友共同探讨:(1) .将雄性wistar大鼠麻醉,开胸,将气管取出,置于4弋含0.1%胰蛋白酶XIV (Sigma), 100 U/ml青 霉素和100ug/ml链霉素(Gibco-BRL)无Ca 2 +、Mg2+,无血清的MEM。(2) . 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁,将所得溶液离心后得到游离细胞。(3) .离心后立即用新鲜的上述MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5%胎 牛血清、100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。(4) .冲洗过后,将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力,若存活率大于90%,则将细胞以106/cm2密度接 种于可通透的多聚碳滤膜上(12 mm SNAPWELL, Costar ),以37C 5%CO2-95%空气含5%胎牛血 清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素 and 100ug/ml 链霉素的 LHC-8 medium 孵育 610 天。(5) .孵育后,经测定跨上皮电阻在100020000之间,即可用于电生理试验。 显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片 链接: 3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验,具体是这么做的:首先把Transwell倒置, 在 Transwell 的 PVPF 膜(0.8 um )的下表面涂一层 fibronectin(10 ug/ml , 50ul),37 度 2 小时,PBS 洗 一遍后,放入预先每孔加有600ul的培养基(含10%血清)的24孔板内,后在Transwell的内室加入细 胞(100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度),放入培养箱,12-18小时后,取出Transwell, 用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟纟吉晶紫染色20分钟, 用清水洗3遍以上,后在显微镜下观察细胞,记数。链接: 4 . mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后,上室加入100川用 serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物,下室加入0.6ml serum-free的 MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照,置于CO2培养箱中作用8小时,然 后弃去孔中培液,用90%酒精常温固定30分钟, 0.1%结晶紫常温染色10分钟,清水漂净,用棉签轻轻 擦掉上层未迁移细胞,显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并拍照,最后用10%乙酸100川/孔抽提10 分钟,于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为:抑制率(% ) =(OD值给药组-OD值无刺激阴性对 照)/ ( OD值不加药阳性对照-OD值无刺激阴性对照)x 100%.链接: Transwell我只做过|肿瘤细胞的侵袭和迁移,其他应用请有经验的战友跟帖吧。附录:Corning公司说明书:附件原始下载地址: Chemicon 公司的 ECM554 :flyingfly战友的好帖:Transwell的选择和实验protocol汇总-丁香园论坛guxuefeng战友的Transwell应用指南:1. 混合培养0.4、3.0pm细胞/细胞、细胞/物质相互作用、基质与上皮、细胞/基质的相互作用、肿瘤多 相性。2. 趋化性3.0、5.0、8.0、12.0pm血液有形成分的趋化性、噬细胞、巨噬细胞的迁移。3. 药物的转移0.4、3.0pm受体定位、药物反应极性、药物作用于血管渗透性、药物通过上皮、内皮细 胞、脑血管上皮细胞。4. Endocytosis 0.4、3.0pm膜同期、细胞因子、激素、抗体、毒素的受体-配体反应、蛋白质更新。5. 体外受精0.4、0.3pm卵泡粒膜细胞培养、内分泌和旁分泌对卵泡粒膜的影响。6. 转移与入侵 0.4、8.0、12.0|im7. 微生物发病0.4、3.0pm病毒细菌、寄生虫、吸附宿主血细胞、入侵穿透上皮屏障、微生物受体及其 药物作用。8. 极性0.4、3.0pm离子通道、蛋白、酶、酯类、受体的极性、极性发生与维持、紧密连接的合成与集 合。9. 组织模型重建0.4、3.0pm伤口愈合、血管发生、上皮再生、感染。10. 转移/渗透性研究0.4、3.0|im大分子、离子、水、小分子、如:激素、生长因子。原文链接:http:/ cosmosci战友的transwell膜和孔径的选择:TRANDSWELL透过性支持物可提供三种膜材料CPET原包被的PTFE.(膜的特性见附件)a、PET膜TRANWELL透明嵌入式的特点是带有在显微镜下呈透明的膜。这些膜经过处,可以让细胞更好 的贴附和生长。TRANSWELL透明嵌入式使细胞在相差显微镜下更易观察,可以估计细胞的生长状态和单 细胞层的形成。b、聚碳酯TRANWELL嵌入膜提供0.1-12pm的多种孑b径。绝大多数经过处理,使得细胞更易贴附。c、TRANSWELL-COL 嵌入膜带有湿润时透明的,胶原包被的 PTFE 膜,使得细胞更易贴附和伸展,同时 在培养的过程中可以观察。TRANSWELL-COL含有牛胎盘中提取的等摩尔数混合I型和III型胶原,不同 于传统包被技术会形成密封的膜层,特殊的技术稳定性的胶原包裹住滤膜的每一根纤维,从而保持了膜的 多孔性。选择孔径:在实验中使用TRANSWELL透过性支持物时选择合适的孔径也是十分重要的,附件2有推荐透过性支持物的常规应用和推荐使用的孔径,最小孔径的TRANSWELL膜(0.1pm)主要应 用于药物转动研究。细胞侵袭、趋化性和运动性研究通常采用 3.0um 或以上的孔径的 TRANSWELL 膜。 细胞从膜的孔中迁徙通过的能力与选用的细胞系与培养条件有关,同时也与孔径相关,小于3.0pm孔径条 件下,细胞不会迁徙通过,对于一些要求严格的实验,建议在实验中选择一系列孔径作为对照来确定哪种 尺寸最适合于你的细胞培养与特殊应用(当然这个建议成本是很高的,呵呵)。还有一个方法就是参照已经 发表的文献的推荐,若需要更多的使用与应用信息,可以到corning的网站技术信息部分的TRANSWELL 查阅参考。 原文链接: zllxash 战友的 protocol具体步骤:(最终版2006-4-1)(1 )基质胶准备:将冻存于-80度冰箱的BD matrigel 4度过夜(24h),变成液态;(2) 取300ul无血清培养基,加入60ul(或50ug/每室)Matrigel,混匀,(4弋操作,最好在冰浴 上),加入上室各100ul(3个室);放入37弋培养箱中,孵育4-5h (5h);此间经常观察,当出现白色 层”时,说明已经变为固态。注释:无血清培养基和基质胶按1 : 5稀释,每孔加50ul,在37弋培养箱中1-2h。(3) 消化细胞,无血清培养基洗3次,计数,配成细胞悬液;(4 )用无血清培养基洗Matrigel洗1次;每孔加入100ul细胞悬液;(5 )下腔室中加入500ul含有20%FBS条件培养基;(6 ) 37C培养箱中,孵育20-24h ;(7)取出transwell用PBS洗2遍,5%戊二醛固定,4C;(8 )加入结晶紫(0.1% )染色或Giemsa染色(5-10min ),室温0.5h , PBS洗2遍,用棉球擦去上 表面细胞,显微镜下观察。链接:回复:【求助】Transwell - 丁香园论坛来源
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