transwell实验(整理版)

第一节 概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。1Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性 的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器(Membrane filters )，也可认为是一种有通透性的支架(permeable supports )。更准确地说,Transwell应该是一种实验技术这项技术的主要材料是Transwell小室Transwell chamber， Transwell insert)，其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而 不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孑b径大小有0.1-12.0pm，根据不同需要可用不同材料，一般 常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane )。下图是一个Transwell装置的纵切面 Fig2寺;Il i椅 f|!i pI yc i e e：e pbt iiT-e将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装 下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而 可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。Fig3应用不同孑径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种 方面的研究。下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具 体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：(1).共培养体系：小于 3.0um 孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0|im以下孔径。常用0.4、3.0|im。我们实验室用的是0.4pm。Fig4将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。(2).趋化性实验可用 5.0、8.0、12.0pm 膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成 分对上室细胞的趋化能力。 细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生 的物质对细胞A的趋化作用。 趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋 化作用。(3) .肿瘤细胞迁移实验常用8.0.12.0pm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分 高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。(4) .肿瘤细胞侵袭实验常用8.0.12.0pm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细Fig5胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室， 先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs )将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映 肿瘤细胞的侵袭能力。第二节 Transwell 侵袭实验我的课题涉及TranswelI侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此 这里主要谈谈 Transwell 侵袭实验。1实验用品：Fig6 Transwell 小室:多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon 公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介 绍的 Thincert。 这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的 Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每 个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不清楚。Coster和Corning公司生产的 小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有 40 左右，应该比较适合 中国国情。下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。linanping1979战友提供的价格:coster 的24孑L板的transwell的价格是456元RMB,8|im,用于肿瘤的侵袭实验。iceyxy战友提供的价格： Millipore的8|im的50个1760RMB,0.4|im的2000多，是一次性的。梅林战友提供的BD价格： 240RMB块(6.5um,24 孔,12instert)，好像是没胶的。liguofan 说国产的 boyden30 块一个。jjyy 提供的价格是:corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950 人民币不到。平均每个20元不到。Transwell 小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的 Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用 前用紫外里外都照30minsword01战友提供的处理方法:用棉签轻轻擦去胶和反面细胞清水冲洗， 超声清洗，低挡，30min，清水3x5min，蒸馏水3x5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反 面6h，微波，低火10minx2。因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前 的Chemicon ECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄 很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说 Costar 和 Corning 也是可以重复用的，大 家可以试试。victoh 战 友 对 Millipore 公 司 的 millicell 有 比 较 详 细 的 讲 解 ， 链 接 如 下 : 本人没见过，有兴趣的可以自己研究一下。另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理。Transwell小室用 过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以 试试。maojianwen战友的使用方法：trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒 精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油(注意用无色较稀的)将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余 的边缘。再照紫外。 上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。 细胞：值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs 的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行TranswelI侵袭实 验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwel l侵袭实验花钱少则数百，多则数千，并不是笔小数目， 还是小心为妙。另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12-24h，再进行实验。 基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和IV型胶原，生产厂家有BD、美国 Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞 外基质，4 度时是液体，在 37 度会逐渐凝固成胶状 ，不可逆。同样的东西在 sigma 叫 ECM。 zhangyong1036战友提供的价格：BD公司的matrigel 1500左右。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。 下层培养液：下层常用含5%-10% FBS的培养基具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适当提高FBS 浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS 仍是最合适的。 细胞培养板：常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孑b最常用。细胞培养 板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室 相配套。 此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin , FN , Sigma有售)，这样做的目的是使穿过 膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原(collagen )或明胶(gelatin )。很多战友认为这不是必须 的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。linanping1979战友认 为，如果培养时间很长(24h),细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层 涂上FN。另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。zhangyong1036战友提供的价格：sigma的fibronectin，价格在1500左右。2步骤2 . 1 Transwell小室制备2.1.1无基质胶Transwell小室制备 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4C风干。如果需要在下室面铺FN 的话，可将200ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen )的话，一般配成 0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37C, 30min另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80|il (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37C 30min使Matrigel聚合成凝胶。2.1.2有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300川预温的无血清培 养基，室温下静置15 - 30min ，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。2.2 制备细胞悬液 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24h ，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用 PBS 洗 12 遍，用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细 胞密度至1- 10x105，个人认为不要超过5x105具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜 的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点， 所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞 预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一 致。23 接种细胞 取细胞悬液100 - 200|11加入TranswelI小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量 有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200川 24孔板下室一般加入500川含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参 考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋 化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小 室放进培养板。 培养细胞：常规培养12 - 48h （主要依癌细胞侵袭能力而定）时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵 袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓 度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后， 抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药 物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照 组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会 有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要 一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内 细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚 集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后， 膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1- 2h把培 养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。24 结果统计检测穿过的细胞数有两种方法：241 直接计数法2411 “贴壁”细胞计数 这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。如下图：Fig7通过给细胞染色，可在镜下计数细胞 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。 个人推荐采用0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：(1). 不需要固定细胞，直接染色即可。(2). 配制简 单方便。(3).染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm测其 OD值，间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。因为，虽然经过准确的细胞计数， 往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制，可能某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下 就难以计数了，这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风 干，否则可能会染不上。 细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝 上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴 二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点浪费。取若干个视野计数细胞个数。论坛里一般采用35个视野，也有人用10个，都是随机选取，个人认为这 样选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候。我选取16个视野， 不是随机选择，而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的 ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。Fig8如图，蓝色部分表示膜的大小，白色圆形表示视野的大小，绿色方形则表示拍照时所能拍下的视野的中心 部分。这样，每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数，这样得到结果是比较客观和准确的。Fig9不同厂家不同型号的小室，膜的面积不尽相同，但个人认为，拍照时还是应当选取固定的位置，并选择尽 可能多的视野。2412 “非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。如下图：Fig10这种情况我没有遇到过，根据论坛里提供的经验，可以收集下层培养液，用流式细胞仪计数细胞量，也可用细胞计数的方法直接在镜下计数，个人认为MTT应该也是可以用的，有兴趣的可以试试看。241 间接计数法间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验 是同样的原理。2.4.1.1 MTT 法 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 24孔板中加入500卩1含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37弋 4h后取出。 24孔板中加入500|il DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶 解。取出小室，24孑b板于酶标仪上测OD值。2.4.1.1 荧光试剂检测这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细 胞裂解，检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。2.4.1.1 结晶紫检测上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过 程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。这里附上我实验中的一些图：上面是用Nikon SMZ1000显微镜配套的数码相机直接对膜下室侧进行拍摄得到的照片，左图是对照组， 中间是1/3 72h IC50的浓度处理组，右图是72h IC50的浓度处理组，接种细胞后同时加入药物，培养 24h，结晶紫染色。随着药物浓度增加，穿过的细胞减少，侵袭力明显受到抑制。这是用正置显微镜拍摄的图，结晶紫染色，进行细胞计数。Fig12Fig11第三节Transwell的其他应用的实验步骤1 . Transwell肿瘤细胞迁移实验过程与Transwell侵袭实验基本一致,不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没有基质胶的阻挡， 细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1x105，而迁移 实验的密度是1x106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实 验的浓度是2.5%。2 . cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤 做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：(1) .将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4弋含0.1%胰蛋白酶XIV (Sigma), 100 U/ml青 霉素和100ug/ml链霉素(Gibco-BRL)无Ca 2 +、Mg2+,无血清的MEM。(2) . 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。(3) .离心后立即用新鲜的上述MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5%胎 牛血清、100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。(4) .冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90%,则将细胞以106/cm2密度接 种于可通透的多聚碳滤膜上(12 mm SNAPWELL, Costar )，以37C 5%CO2-95%空气含5%胎牛血 清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素 and 100ug/ml 链霉素的 LHC-8 medium 孵育 610 天。(5) .孵育后，经测定跨上皮电阻在100020000之间，即可用于电生理试验。 显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片 链接： 3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置， 在 Transwell 的 PVPF 膜(0.8 um )的下表面涂一层 fibronectin(10 ug/ml , 50ul),37 度 2 小时，PBS 洗 一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基(含10%血清)的24孔板内，后在Transwell的内室加入细 胞(100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度)，放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell, 用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟纟吉晶紫染色20分钟， 用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。链接： 4 . mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100川用 serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6ml serum-free的 MCDB131培液及20%FCS刺激迁移，同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然 后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟， 0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻 擦掉上层未迁移细胞，显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并拍照，最后用10%乙酸100川/孔抽提10 分钟，于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率(% ) =(OD值给药组-OD值无刺激阴性对 照)/ ( OD值不加药阳性对照-OD值无刺激阴性对照)x 100%.链接： Transwell我只做过|肿瘤细胞的侵袭和迁移，其他应用请有经验的战友跟帖吧。附录：Corning公司说明书：附件原始下载地址： Chemicon 公司的 ECM554 :flyingfly战友的好帖：Transwell的选择和实验protocol汇总-丁香园论坛guxuefeng战友的Transwell应用指南：1. 混合培养0.4、3.0pm细胞/细胞、细胞/物质相互作用、基质与上皮、细胞/基质的相互作用、肿瘤多 相性。2. 趋化性3.0、5.0、8.0、12.0pm血液有形成分的趋化性、噬细胞、巨噬细胞的迁移。3. 药物的转移0.4、3.0pm受体定位、药物反应极性、药物作用于血管渗透性、药物通过上皮、内皮细 胞、脑血管上皮细胞。4. Endocytosis 0.4、3.0pm膜同期、细胞因子、激素、抗体、毒素的受体-配体反应、蛋白质更新。5. 体外受精0.4、0.3pm卵泡粒膜细胞培养、内分泌和旁分泌对卵泡粒膜的影响。6. 转移与入侵 0.4、8.0、12.0|im7. 微生物发病0.4、3.0pm病毒细菌、寄生虫、吸附宿主血细胞、入侵穿透上皮屏障、微生物受体及其 药物作用。8. 极性0.4、3.0pm离子通道、蛋白、酶、酯类、受体的极性、极性发生与维持、紧密连接的合成与集 合。9. 组织模型重建0.4、3.0pm伤口愈合、血管发生、上皮再生、感染。10. 转移/渗透性研究0.4、3.0|im大分子、离子、水、小分子、如：激素、生长因子。原文链接：http：/ cosmosci战友的transwell膜和孔径的选择：TRANDSWELL透过性支持物可提供三种膜材料CPET原包被的PTFE.（膜的特性见附件）a、PET膜TRANWELL透明嵌入式的特点是带有在显微镜下呈透明的膜。这些膜经过处，可以让细胞更好 的贴附和生长。TRANSWELL透明嵌入式使细胞在相差显微镜下更易观察，可以估计细胞的生长状态和单 细胞层的形成。b、聚碳酯TRANWELL嵌入膜提供0.1-12pm的多种孑b径。绝大多数经过处理，使得细胞更易贴附。c、TRANSWELL-COL 嵌入膜带有湿润时透明的，胶原包被的 PTFE 膜，使得细胞更易贴附和伸展，同时 在培养的过程中可以观察。TRANSWELL-COL含有牛胎盘中提取的等摩尔数混合I型和III型胶原，不同 于传统包被技术会形成密封的膜层，特殊的技术稳定性的胶原包裹住滤膜的每一根纤维，从而保持了膜的 多孔性。选择孔径：在实验中使用TRANSWELL透过性支持物时选择合适的孔径也是十分重要的，附件2有推荐透过性支持物的常规应用和推荐使用的孔径，最小孔径的TRANSWELL膜（0.1pm）主要应 用于药物转动研究。细胞侵袭、趋化性和运动性研究通常采用 3.0um 或以上的孔径的 TRANSWELL 膜。 细胞从膜的孔中迁徙通过的能力与选用的细胞系与培养条件有关，同时也与孔径相关，小于3.0pm孔径条 件下，细胞不会迁徙通过，对于一些要求严格的实验，建议在实验中选择一系列孔径作为对照来确定哪种 尺寸最适合于你的细胞培养与特殊应用（当然这个建议成本是很高的，呵呵）。还有一个方法就是参照已经 发表的文献的推荐，若需要更多的使用与应用信息，可以到corning的网站技术信息部分的TRANSWELL 查阅参考。 原文链接： zllxash 战友的 protocol具体步骤：(最终版2006-4-1)(1 )基质胶准备：将冻存于-80度冰箱的BD matrigel 4度过夜(24h),变成液态；(2) 取300ul无血清培养基，加入60ul(或50ug/每室)Matrigel，混匀，(4弋操作，最好在冰浴 上)，加入上室各100ul(3个室)；放入37弋培养箱中，孵育4-5h (5h);此间经常观察，当出现白色 层”时，说明已经变为固态。注释：无血清培养基和基质胶按1 : 5稀释，每孔加50ul，在37弋培养箱中1-2h。(3) 消化细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液；(4 )用无血清培养基洗Matrigel洗1次；每孔加入100ul细胞悬液；(5 )下腔室中加入500ul含有20%FBS条件培养基；(6 ) 37C培养箱中，孵育20-24h ；(7)取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4C;(8 )加入结晶紫(0.1% )染色或Giemsa染色(5-10min )，室温0.5h , PBS洗2遍，用棉球擦去上 表面细胞，显微镜下观察。链接：回复：【求助】Transwell - 丁香园论坛来源