第五章酶化学

酶催化的生物化学反应，称为酶促反应（酶催化的生物化学反应，称为酶促反应（Enzymatic reaction）。）。大多数酶是蛋白质大多数酶是蛋白质依据：依据：某些某些RNARNA有催化活性有催化活性19821982年美国年美国T.CechT.Cech等人发现四膜虫的等人发现四膜虫的rRNArRNA前体能前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNARNA有催化活性有催化活性 核酶（核酶（ribozyme）酶与一般催化剂比较酶与一般催化剂比较共性共性 （1 1）用量少而催化效率高：）用量少而催化效率高：（2 2）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反应前后）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反应前后本身不发生变化；本身不发生变化；（3 3）降低反应所需的活化能）降低反应所需的活化能 酶作为生物催化剂的酶作为生物催化剂的特性特性 （1 1）高效率）高效率 以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高10107 710101313倍，比非催化反应高倍，比非催化反应高10108 810102020倍。倍。例例：2H2O22H2O+O2（2 2）专一性）专一性即酶只能对特定的一种或一类底物起作用，即酶只能对特定的一种或一类底物起作用，这种专一性是由酶蛋白的立体结构所决定的。这种专一性是由酶蛋白的立体结构所决定的。蛋白质部分：酶蛋白蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme)辅因子辅因子(cofactor)金属离子金属离子小分子有机化合物小分子有机化合物全酶全酶(holoenzyme)辅因子分类辅因子分类（按其（按其与酶蛋白结合的紧密程度与酶蛋白结合的紧密程度）辅酶辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合与酶蛋白结合疏松，可用疏松，可用透析或超滤的透析或超滤的方法除去。方法除去。辅基辅基(prosthetic group):与酶蛋白结合与酶蛋白结合紧密，不能用紧密，不能用透析或超透析或超滤的方法除去滤的方法除去。酶的不同形式酶的不同形式单体酶单体酶(monomeric enzyme)(monomeric enzyme)：仅由单一肽链组仅由单一肽链组成的具有完全催化活性的酶。成的具有完全催化活性的酶。寡聚酶寡聚酶(oligomeric enzyme)(oligomeric enzyme)：由多个相同或由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。不同亚基以非共价键连接组成的酶。多酶体系多酶体系(multienzyme system)(multienzyme system)：由几种不同由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。2、酶的命名与分类酶的命名与分类(一一)习惯命名法习惯命名法(二二)国际系统命名法国际系统命名法系统名应包括；系统名应包括；底物（构型）底物（构型）（酶作用的基团）（酶作用的基团）、催化反应的类型、催化反应的类型习惯名称习惯名称系统名称系统名称谷丙转氨酶谷丙转氨酶丙氨酸丙氨酸 ：酮戊二酸酮戊二酸氨基转移酶氨基转移酶乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶 乙醇：乙醇：NAD+氧化还原酶氧化还原酶CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH(2)(2)转移酶转移酶 TransferaseTransferaseCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO(3)(3)水解酶水解酶 hydrolasehydrolaseH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH(4)(4)裂合酶裂合酶 LyaseLyaseHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH(5)(5)异构酶异构酶 IsomeraseIsomeraseOCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOH(6)(6)合成酶合成酶 Ligase or SynthetaseLigase or SynthetaseEC 1.1.1.27CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH1、必需基团、必需基团：与酶的催化活性直接相关：与酶的催化活性直接相关概念：概念：结合基团结合基团binding group催化基团催化基团(catalytic group)促进底物发生化学变化促进底物发生化学变化 赖赖缬缬天天天天天天天天甘甘异异赖赖缬缬天天天天天天天天缬缬组组丝丝甘甘异异缬缬组组丝丝 酶原激活的机理酶原激活的机理酶酶 原原分子构象发生改变分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽掉一个或几个短肽在特定条件下在特定条件下 酶原激活的生理意义酶原激活的生理意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。酶原激活的本质酶原激活的本质酶原激活酶原激活胰蛋白酶原胰蛋白酶原肠激酶肠激酶 六肽六肽胰蛋白酶胰蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶原羧肽酶羧肽酶共价修饰共价修饰(covalent modification)在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽链上的一些在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。酶的活性，此过程称为共价修饰。（1）活性中心的概念：或称活性部位）活性中心的概念：或称活性部位(active site)酶是蛋白质，是大分子化合物，在这样一个酶是蛋白质，是大分子化合物，在这样一个大分子中只有一小部分是与底物结合，并与催化大分子中只有一小部分是与底物结合，并与催化作用直接有关，这个部位就是酶的活性中心。作用直接有关，这个部位就是酶的活性中心。1、活性中心、活性中心(active center)组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有GluGlu和和ASPASP的的-COOH-COOH，LysLys的的-NH-NH2 2，HisHis的咪唑基，的咪唑基，SerSer的的-OH-OH，CysCys的的-SH-SH，TyrTyr的侧链基团。的侧链基团。酶活性中心酶活性中心 结合部位：与底物结合的部分结合部位：与底物结合的部分 （特异性决定部位）（特异性决定部位）催化部位：促进底物发生化学变化的部分催化部位：促进底物发生化学变化的部分结合基团结合基团binding group催化基团催化基团(catalytic group)催化底物转变成产物催化底物转变成产物 位于活性中心以外，维持酶活性中心应有位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。的空间构象所必需。活性中心外的必需基团活性中心外的必需基团底底 物物 活性中心以外活性中心以外的必需基团的必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 静态酶静态酶调节酶：限速酶、关键酶，调节酶：限速酶、关键酶，静态酶：静态酶：调节酶：调节酶：聚合：活性态聚合：活性态解聚：是否具有活性由解聚条件决定解聚：是否具有活性由解聚条件决定聚合：活性态聚合：活性态解聚：非活性解聚：非活性 大多数大多数 （少数情况相反）（少数情况相反）乳酸脱氢酶的同工酶乳酸脱氢酶的同工酶乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 LDH5骨骼肌骨骼肌:乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 心肌心肌:LDH1血清血清LDH同工酶酶谱的变化规律同工酶酶谱的变化规律 节首化学反应过程化学反应过程 A+B AB C +D 反应物（初态）反应物（初态）中间产物（过渡态中间产物（过渡态）产物（终态）产物（终态）l从反应物（初态）转化成中间产物（过渡态）需要从反应物（初态）转化成中间产物（过渡态）需要的能量即活化能，活化能越大，反应越难进行。的能量即活化能，活化能越大，反应越难进行。1.加速化学反应的方法：加速化学反应的方法：-向反应体系提供能量向反应体系提供能量 -降低活化能降低活化能酶促反应活化能的改变酶促反应活化能的改变反应总能量改变反应总能量改变酶促反应活化能酶促反应活化能非催化反应活化能非催化反应活化能 一般催化剂催一般催化剂催化反应的活化能化反应的活化能能能量量反反 应应 过过 程程底物底物产物产物酶的催化效率通常比非催化反应高酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，倍，比一般催化剂高比一般催化剂高1071013倍。倍。酶的催化不需要较高的反应温度。酶的催化不需要较高的反应温度。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能活化能(activation energy)。酶比一般催化剂更有。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。效地降低反应的活化能。关于酶作用专一性的几种假说关于酶作用专一性的几种假说 （lock and Key theory）2、诱导契合学说（、诱导契合学说（induced-fit theory）酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，但酶酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，但酶的活性中心具有一定的柔性，两者相遇底物诱导的活性中心具有一定的柔性，两者相遇底物诱导酶构象发生变化，才形成了互补形状。酶构象发生变化，才形成了互补形状。共价催化共价催化 亲电催化亲电催化 亲核催化亲核催化 影响酸碱催化的因素影响酸碱催化的因素酸碱的强度酸碱的强度功能基提供质子和接受质子的速度功能基提供质子和接受质子的速度His的咪唑基的咪唑基 是酶的酸碱催化作用中最有效、最活是酶的酸碱催化作用中最有效、最活泼的一个催化功能团，是许多酶的活性中心的构泼的一个催化功能团，是许多酶的活性中心的构成成分。成成分。咪唑基咪唑基：解离常数为：解离常数为6.0；半衰期小于；半衰期小于10-10s.当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。反应为一级反应。随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。为混合级反应。当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应反应为零级反应VmaxS Km+S S：底物浓度底物浓度V：不同不同S时的反应速度时的反应速度Vmax：最大反应速度最大反应速度(maximum velocity)m：米氏常数米氏常数(Michaelis constant)E+S k1k2k3ESE+P以反应产物以反应产物P的生成速度代表这个酶促反应速度的生成速度代表这个酶促反应速度v，则：则：V=K3ES (2)ES的生成速度的生成速度K1ESES的分解速度的分解速度K2ES+K3 ES=(K2+K3)ES 当反应体系中当反应体系中ES达到动态平衡时，达到动态平衡时，ES的生成速度的生成速度 ES的分解速度，即：的分解速度，即：K1ES=(K2+K3)ES(1)132KKKESSE132)(KKKKmmKESSE)()(000SESESESKSESEESKESSESEKmmm)(0SKSEESm所以：所以：（4）将（将（4）带入（）带入（2），得：），得：（5)(03SKSEKvmVmaxKmS Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是时的底物浓度，单位是mol/L。2Km+S Vmax VmaxSl 意义：意义：Vmax=K3 E（1）l -4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v斜率斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmax 测定测定Km可以作为鉴别酶的一种手段，可以作为鉴别酶的一种手段，但必须是在指定的实验条但必须是在指定的实验条件下。件下。0 V E 当当SE时，时，Vmax=k3 E 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响 102030405060708090020406080100Temperature OCRelative Activity(%)3、最适温度不是酶的特征性物理常数、最适温度不是酶的特征性物理常数2345678910020406080100pHRelative Activity(%)0酶酶活活性性 pH pH对某些酶活性的影响对某些酶活性的影响 246810 l最适最适pH不是酶的特征常数不是酶的特征常数。l抑制剂对酶有一定选择性抑制剂对酶有一定选择性l 引起变性的因素对酶没有选择性引起变性的因素对酶没有选择性不可逆性抑制不可逆性抑制(irreversible inhibition)可逆性抑制可逆性抑制(reversible inhibition)：竞争性抑制竞争性抑制 (competitive inhibition)非竞争性抑制非竞争性抑制 (non-competitive inhibition)反竞争性抑制反竞争性抑制 (uncompetitive inhibition)（reversible inhibition)reversible inhibition)概念概念：抑制剂与酶蛋白以非共价键结合，具有可逆：抑制剂与酶蛋白以非共价键结合，具有可逆性，可用透析、过滤等方法将抑制剂除去。性，可用透析、过滤等方法将抑制剂除去。结合部位结合部位：活性中心，非活性中心：活性中心，非活性中心结合方式结合方式：非共价键：非共价键 *特点特点b)b)抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度；及底物浓度；a)I与与S结构类似，竞争酶的活性中心；结构类似，竞争酶的活性中心；*举例举例 丙二酸丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶COOH CH2 CH2COOH COOH COOH CH2 丙二酸丙二酸琥珀酸琥珀酸琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸延胡索酸+反应模式反应模式*特点特点a)a)抑制剂与酶活性中心外的必需基团抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关结合，底物与抑制剂之间无竞争关系；系；b)b)抑制程度取决于抑制剂的浓度；抑制程度取决于抑制剂的浓度；一、酶的制备及纯化一、酶的制备及纯化1选材选材2破碎细胞破碎细胞3抽提抽提4去核酸、去多糖去核酸、去多糖5纯化纯化6保存保存由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意:1全部操作在低温全部操作在低温04。2在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。3在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量、少量-巯基巯基乙醇。乙醇。4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。而求得比活力，还要计算总活力。Pt测定酶活力时注意应测定酶活力时注意应测反应初速度测反应初速度（initial velocity）：底物被消耗底物被消耗5%以内以内的速度反应速度。的速度反应速度。斜率=v酶的活性单位酶的活性单位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在是衡量酶活力大小的尺度，它反映在规定条件下，酶促反应在单位时间（规定条件下，酶促反应在单位时间（s、min或或h）内生成一定量（内生成一定量（mg、g、mol等）的产物或消等）的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。耗一定数量的底物所需的酶量。l国际单位国际单位(IU)在标准条件下，每分钟催化在标准条件下，每分钟催化1mol底物转化为底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位。产物所需的酶量为一个国际单位。（标准条件？）（标准条件？）l催量单位催量单位(katal)催量催量(kat)是指在最适条件下，每秒钟使是指在最适条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所需的酶量。底物转化为产物所需的酶量。kat与与IU的换算：的换算：1 IU=16.6710-9 katl比活力说明酶的纯度。比活力说明酶的纯度。5.0110001014AAK660660）（酶活力空白样品 Csmol/LV mol/(Lmin)Csmol/LV mol/(Lmin)1.310-5122.010-3601.510-4452.010-2602.010-4482.010-160五、计算题：米氏方程、酶活力五、计算题：米氏方程、酶活力