实验3 叶绿体色素的提取

实验 3 叶绿体色素的提取、分离和含量的测定一、实验目的：1、掌握叶绿体色素的提取、分离和含量的测定的方法。2、掌握分光光度计的应用。二、实验原理：1分光光度法测定叶绿素含量 叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜 等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分 光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度（也称为光密度），再根据叶绿素在该波长下 的吸收系数即可计算叶绿素含量。根据比尔定律，利用叶绿素a和b吸收光谱的不同，测定 各特定峰值波长下的光密度,再根据色素分子在该波长下的消光系数,计算出浓度. 叶绿 素a的80%丙酮提取液的最大吸收峰为663nm,叶绿素b的吸收峰为645nm.这样,叶绿素a 和 b 在两种波长下浓度与光密度的关系可用下式表示:D663= 82.04 Ca + 9.27 CbD645= 16.75 Ca + 45.60 Cb （单位:毫克/升）解得:CA = 12.7 D663 - 2.69 D645CB = 22.9 D645 - 4.67 D663CT = CA + CB = 20.3 D645 + 8.04 D663 CK = 4.7D440 -.27 C a+b式中：CA、CB分别为叶绿素a和b的浓度,CT为叶绿素总浓度，CK为类胡萝卜素 浓度. 式中单位:毫克/升2叶绿体色素的分离原理（纸层析法） 它的原理是利用混合色素中各个成分物理、化学性质的差别，分别以不同程度分布 于两相中（即固定相和流动相）。由于它们以不同的速度移动，从而达到分离的目的。三、材料用具及器材药品：（1）层析液配方：石油醚:乙醚：4： 1 （V/V）（2）天平、研钵、石英砂、碳酸钙、烧杯、量筒、滤纸、表面皿、剪刀、 80%丙酮、 25ml 容量瓶、漏斗、滴管、比色皿、载玻片（3）菠菜叶子四、实验步骤：1. 分光光度法测定叶绿素含量取菠菜（或其他植物）叶子2g,洗净，擦干，剪碎，放在研钵中，加石英砂和碳酸钙 少许，80%丙酮约2-3ml，研磨成匀浆，再加80%丙酮定容至25m 1,用漏斗过滤，即为 色素提取液。稀释5倍后将稀释液放进分光光度计中进行测定，分别调至A645、A663、A440,记录。 计算色素含量公式：CA = 12.7 D663 - 2.69 D645CB = 22.9 D645 - 4.67 D663CT = CA + CB = 20.3 D645 + 8.04D663CK = 4.7D440 0.27 C a+b.叶绿素含量 （mg/g 鲜重）=叶绿素浓度（mg /I ） X 提取液总体积（ml）重量（g） X 1000式中：CA、CB分别为叶绿素a和b的浓度，CT为叶绿素总浓度，CK为类胡萝 卜素浓度. 式中单位:毫克/升2. 叶绿体色素的分离（纸层析法）（1）点样。取前端剪成三角形的滤纸条，用载玻片边缘沾取上面的色素提取液点样， 点样后晾干，重复操作4-5次，以制备色素线。（2）分离。将滤纸条两角剪掉，尖端浸入盛层析液的烧杯中，（注意：色素线要略高于 层析液面，且滤纸条边缘最好不要碰到烧杯壁）（3）推动剂前沿接近滤纸边缘时，观察色素带的分布。五、实验现象和结果：1. 采用分光光度计测量的结果为：A645：0.315A663： 0.686A440：1.366计算：CA = 12.7 D663 - 2.69 D645=12.7*0.6862.69*0.315=7.865CB = 22.9 D645 - 4.67 D663=22.9*0.3154.67*0.686=4.0099CT = CA + CB = 20.3 D645 + 8.04D663=11.909CK = 4.7D440 0.27 C a+b.=3.214Ck/Ct=3.214/11.909=0.27叶绿素含量 （mg/g 鲜重）=叶绿素浓度（mg /I ） X 提取液总体积（ml）重量（g） X 1000=3.214*25*5/2*1000=0.2009 （mg/g）2. 叶绿体色素带：六、分析和讨论：1. 得出的叶绿体色素带为叶绿素 a 为蓝绿色，叶绿素 b 为黄绿色，叶黄素为黄色，胡萝 卜素为橙黄色。2. 实验研磨叶片过程中不能暴露在强光下，这是因为要防止叶绿素见光易分解，同时防 止丙酮挥发，丙酮有毒。3. 在实验中滤液细线不能触及层析液，滤液细线若泡在层析液里,那么色素就会溶解到烧杯 里的层析液中,从而不能在纸条上得到色带。4. 在研磨叶片过程中，如果研磨不够充分，则在过滤后的色素浓度偏低，会影响实验效果。七、实验结论：1.叶绿素含量为0.2009 (mg/g)。2.叶绿体色素由叶绿素a,叶绿素b,叶黄素，胡萝卜素组成。八、思考题：1、叶绿素提取中为什么要加碳酸钙？ 答：防止研磨过程中色素被破坏。2、叶绿素提取中为什么要用80%丙酮？而不是 100%丙酮？ 答：叶绿素在丙酮等有机溶剂中易溶解，在做叶绿素层析的时候，其原理就 是利用不同叶绿素在层析液中的溶解度不一样，在滤纸上引起扩散速度不同。 如果是 100%的话，几种叶绿素在丙酮中的溶解度都差不多，就不能达到理 想的分离效果，如果采用 80%的话 能有效的将4 种色素溶解并造成不同的 溶解度。3、为什么植物在不同生长环境下其Chi含量有差异？ Chia /Chib有何适应意义？ 答：叶绿素在光合作用下起到吸收光能、传递光能的作用，而少量的叶绿素a还具有光 能转换的作用，所以叶绿素a含量比叶绿素b的要高。在阴生植物中叶绿素a与叶绿素 b 的含量要高于阴生植物中的含量，且阳生植物中的叶绿素含量比值要高于阳生植物的 比值。因为阴生植物能在弱光下进行光合作用，叶绿素是植物吸收光能进行光合作用的 重要物质，因此，吸光能力强的植物中叶绿素含量高，且叶绿素a所占比值高。