SOD、POD、CAT、MDA联合测定方法

酶液提取:称取鲜叶样品。0.5g于预冷的研钵中，加lml0.05mol/lpH7.0磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。将提取液于10000转/分冷冻离心20分钟，上清液用于测定SOD,POD,CAT活力测定及丙二醛含量测定。SOD：测定SOD活性的试剂配制及用量： 磷酸缓冲液(PH7.8)0.05moI/L3.1m1，空白为3.2m1; EDTA-Na1mg/m10.2mL; L一甲硫氨酸20mg/mL0.2m1; 核黄素0.1mg/ml，吸取上清液0.2m1; NBTlmg/ml0.2m1; 提取酶液0.1ml,空白不加酶液。反应总体积为4m1,第1组、4000Lx光照30min，遮黑布终止反应。第2组、黑暗处理30min。置560nm处测定光密度。SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%作为一个酶活性单位(u)，按以下公式计算SOD活性：SOD总活性(血打肛卜匚AckxxWxVt2式中，Ack为照光管的吸光度值;AE为遮光管的吸光度值:V为样品液总体积(ml);Vt为测定时样品用量(ml);W为样品鲜重。POD：在试管中依次加入4m10.3%愈创木酚(0.02mo1/1pH6磷酸缓冲液配置)、50ul酶液、50ul0.3%H0，22摇匀，立即计时，1分钟后在470nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值,连续记录5分钟。以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)，按下式计算过氧化物酶活性：过氧化物酶活性(U/gFW.min)二一,WxKsxO.Olxf式中：dA470为反应时间内吸光度的变化:Vt为提取液总体积(ml);W为样品鲜重(g)；Vs为测定时取用酶液体积(ml);t为反应时间(min)。CAT取酶提取液50u1，加入3m10.05mol/1pH7.0磷酸缓冲液，再加入0.3%H0200u1，22迅速摇匀，立即计时，1分钟后在UV-754分光光度计的240nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。以每分钟内A240下降0.01为1个酶活性单位(U)，按下式计算过氧化氢酶活性：过氧化氢酶活性(U/gFW.min)二山珊*,WxPixO.Olxr式中：AA为反应时间内吸光度的变化;Vt为提取液总体积(ml):w为样品鲜重240(g);Vs为测定时取用酶液体积(ml);t为反应时间(min)MDA取上清液1.5m1，加入2.5m10.5%的硫代巴比妥酸(TBA)(用10%三氯乙酸配制)。混合物于100C沸水浴中加热20min，迅速冷却，于10000转/分离心20分钟,分别测定上清液在450,532nm及600nm处的吸光度值。按以下公式计MDA浓度C(umol/1)和含量(nmollgFW):C(umol/1)=6.45X(A532-A600)-0.56XA450MDA含量（nmo!/gFW-提取菠总俐鈕同)测定时用提取丽郦