第一节核酸的分离纯化

分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。DNA分子的切割与连接分子的切割与连接核酸分子杂交核酸分子杂交凝胶电泳凝胶电泳细胞转化细胞转化核酸序列分析核酸序列分析基因的人工合成基因的人工合成基因操作基因操作基因的定点突变基因的定点突变PCR扩增等扩增等核心技术核心技术基因工程诞生的基础1、理论上的三大成就2、技术上的二大发明三大三大成就成就：1.1.40 40年代确定了遗传信息的携带者，即年代确定了遗传信息的携带者，即基因基因的分子载体是的分子载体是DNADNA而不是蛋白质，解决了遗传而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；的物质基础问题；1928 Frederick Griffith&1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae1952年年Hershey和和Chase证实噬菌体证实噬菌体DNA侵染细菌实验侵染细菌实验2.2.50 50年代揭示了年代揭示了DNADNA分子的双螺旋结构模型和半分子的双螺旋结构模型和半 保留复制保留复制机制机制,解决了基因的自我复制和世代交解决了基因的自我复制和世代交替问题；替问题；X-ray sourceCrystallized DNARosalind Franklin拍出拍出 了第一张了第一张能反映能反映DNA美丽双螺旋结构的美丽双螺旋结构的X射线照片射线照片 Maurice WilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&WilkinsDescription of the 3-D structure of DNAFrancis Crick&James Watson三位科学家因为对这一 成果的贡献，共享1962年的诺贝尔生物学奖 Conservative ModelSemiconservative ModelFrank StahlMatt MeselsonParent cellFirst replicationSecond replication1958-Matthew Meselson&Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway3.3.50 50年代末至年代末至6060年代，相继提出了年代，相继提出了 中心法则中心法则 和操和操纵子学说纵子学说,成功地成功地破译了遗传密码破译了遗传密码，充分认识了遗传，充分认识了遗传信息的流动和表达。信息的流动和表达。Jacob and Monod但是，如果没有分离和富集单但是，如果没有分离和富集单一一DNADNA分子的技术，科学家就无分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化法对这类物质进行直接的生化分析。分析。两大两大技术保证：技术保证：1.DNA1.DNA的体外切割和连接的体外切割和连接19621962年年Arber Arber 发现发现限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶，1967Gellert1967Gellert发现了发现了 DNA DNA 连接酶（连接酶（DNA ligase DNA ligase）一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖Herbert Boyer,Herbert Boyer,Stanley CohenStanley Cohen19721972年获得年获得第一第一个重组个重组DNADNA分子分子(实现不同来源实现不同来源DNADNA的重组的重组)Herbert Boyer1972-Paul BergProduced first recombinant DNA using EcoRIEcoRI recognition sites phage DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky endSV40 DNAThe two fragments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant DNA1973-Boyer,Cohen&ChangTransform E.coli with recombinant plasmidStanley Cohen&Annie ChanHerbert BoyerKanamycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resistance geneE.coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracyclineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce colonies2.DNA2.DNA的核苷酸序列分析技术的核苷酸序列分析技术 DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。General process of gene engineering1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。5.5.将目的基因克隆到将目的基因克隆到表达载体表达载体上，导入寄主细胞，使之在上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。之间的关系。前言前言一、核酸分离、纯化原则一、核酸分离、纯化原则（一）（一）保持核酸分子一级结构的完整性保持核酸分子一级结构的完整性（二）（二）防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解二、分离提取核酸的主要步骤二、分离提取核酸的主要步骤（一）（一）细胞的破碎细胞的破碎（二）（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核蛋白的解聚、变性蛋白的去除（三）（三）核酸的沉淀核酸的沉淀 (四）四）核酸的浓度测定核酸的浓度测定（五）（五）核酸的保存核酸的保存 核酸核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。前前 言言Home（一）保持核酸分子一级结构的完整性（一）保持核酸分子一级结构的完整性 1 1 意义意义 遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的的级结构还决定其高级结构的形式以及和其级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。他生物大分子结合的方式。2 2 分离核酸原则：分离核酸原则：1 1）温度）温度不要过高；不要过高；2 2）控制一定的控制一定的pHpH值值范围范围(pH(pH值值5-9);5-9);3 3）保持一定的保持一定的离子强度离子强度;4 4）减少物理因素对核酸降解的减少物理因素对核酸降解的机械剪切力机械剪切力.Home 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温所用器械和一些试剂需高温灭菌灭菌，提取缓，提取缓冲液中需加冲液中需加核酸酶抑制剂核酸酶抑制剂。1 1）金属离子螯合剂：金属离子螯合剂：DNADNA酶需要金属二价离子酶需要金属二价离子MgMg2+2+、CaCa2+2+的激活，因的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNADNA酶活性。酶活性。如如EDTA-NaEDTA-Na2 2(乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠)、8-8-羟基喹啉；羟基喹啉；2 2）阴离于型表面活性剂：阴离于型表面活性剂：如如SDSSDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。RNAase分布广泛，极易污染样品，而分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。(1)皂土（皂土（bentonite）作用机制：作用机制：皂土带负电荷，能皂土带负电荷，能吸附吸附RNase，使其失活。使其失活。(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：作用机制：与蛋白质中与蛋白质中His结合使蛋白变性。结合使蛋白变性。使用注意：使用注意：1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大但浓度比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。倍。2）容易降解，保存在）容易降解，保存在4 或液氮中；或液氮中；3）提）提RNA时，时，0.1%DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2 h。4）剧毒）剧毒。（3)3)肝素肝素（4 4）复合硅酸盐（）复合硅酸盐（Macaloid)Macaloid)（5 5）RNaseRNase阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasinRNasin）（6 6）氧钒核糖核苷复合物）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-(Vanadyl-Ribonucleoside Complex,VRC)Ribonucleoside Complex,VRC)Home（一）细胞的破碎（一）细胞的破碎 1 1 高速组织捣碎机捣碎高速组织捣碎机捣碎 2 2 玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆 3 3 超声波处理法超声波处理法 4 4 液氮研磨法液氮研磨法 5 5 化学处理法化学处理法(SDS(SDS、LDSLDS，吐温，吐温8080等）等）6 6 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）生化法（溶菌酶、纤维素酶等）Home（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力吸力(核酸与碱性蛋白的结合核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非、氢键和非极性的范德华力。极性的范德华力。分离核酸分离核酸最困难最困难的是将与核酸紧密结合的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。的蛋白质分开，同时避免核酸降解。常用方法：常用方法：1 加入浓盐溶液（如加入浓盐溶液（如NaCl）核酸核酸-蛋白质加入蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；使氢键破坏，核蛋白解聚；2 加入加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；3 酚酚/氯仿抽提氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。素和蔗糖的作用。在酚在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为为防止起泡和促使水相与有机相的分离防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一，再加上一定量的异戊醇（定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉酚：氯：异戊醉=25=25：2424：1 1）。1 1）使用注意）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。2 2）安全操作）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。应戴手套。使用酚时应注意使用酚时应注意Home 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点优点：改变核酸的溶解缓冲液；改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。去除溶液中某些盐离子与杂质。盐盐贮存液浓度（贮存液浓度（mol/L)终浓度终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8 （1 1）乙醇）乙醇优点：优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。挥发除去，不影响以后实验。缺点：缺点：需要量大，一般要求低温操作。需要量大，一般要求低温操作。（2）异丙醇）异丙醇优点：优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNADNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点缺点：易使盐类、蔗糖与易使盐类、蔗糖与DNADNA共沉淀异丙醇难以挥共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用发除去。所以，最后用7070乙醇漂洗数次。乙醇漂洗数次。（3）聚乙二醇（）聚乙二醇（PEG）优点：优点：可用不同浓度的可用不同浓度的PEGPEG选择沉淀不同相对分子质量选择沉淀不同相对分子质量的的DNADNA片段。应用片段。应用60006000相对分子质量相对分子质量的的PEGPEG进行进行DNADNA沉淀时，使用浓度与沉淀时，使用浓度与DNADNA片段的大小成反比。片段的大小成反比。注意：注意：PEGPEG沉淀一般需要加入沉淀一般需要加入0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10mmol/L10mmol/L的的MgClMgCl2 2。要除去。要除去DNADNA沉淀中沉淀中PEGPEG。精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNADNA。原理是：原理是：精胺与精胺与DNADNA结合后，使结合后，使DNADNA在溶液中结构凝在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与杂质与DNADNA分开，达到纯化分开，达到纯化DNADNA的目的。的目的。一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与低温长时间沉淀，易导致盐与DNADNA共沉淀，共沉淀，影响以后的实验。一般使用影响以后的实验。一般使用00冰水，冰水，10-10-15min15min，DNADNA样品足可达到实验要求。样品足可达到实验要求。Home 1 1 紫外分光光度法测定紫外分光光度法测定DNADNA和和RNARNA的含量的含量 前提：前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于测定浓度应大于0.25 g/ml。结论：结论：在波长在波长260nm260nm紫外光下，紫外光下，1 OD1 OD值的吸光度值的吸光度相当于双链相当于双链DNADNA浓度为浓度为50g/ml50g/ml；单链；单链DNADNA为为37 37 g/mlg/ml；RNARNA为为40 ug/ml40 ug/ml。DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1g/ml时，DNA钠盐的OD2600.02当OD2601时，dsDNA浓度约为50g/ml ssDNA浓度约为37g/ml RNA浓度约为40g/ml原理：核酸在260nm处有最大吸收峰蛋白质在280nm处有最大吸收峰盐和小分子在230nm处有最大吸收峰OD260/OD2801.7OD260/OD2302.01 OD260=50 g/mL DNAa a吸取一定量的吸取一定量的DNADNA样品或样品或RNARNA样品，加水至特定体积样品，加水至特定体积 后，转入分光光度计的石英比色杯中。后，转入分光光度计的石英比色杯中。b b分光光度计先用一定量的水分光光度计先用一定量的水校正零点校正零点。c c测定待测样品在测定待测样品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值。值。d d计算浓度。计算浓度。双链双链DNADNA样品浓度样品浓度(g/l)=OD(g/l)=OD260260核酸稀释倍数核酸稀释倍数 50/100050/1000；RNARNA样品浓度样品浓度(g/l)=OD(g/l)=OD260260核酸稀释核酸稀释倍数倍数40/100040/1000。e e分析纯度。分析纯度。A：测：测DNA：纯的纯的DNA样品样品OD260/OD280应为应为1.8，OD260mOD230应大于应大于2.0。1)OD260/OD280大于大于1.9时，表明有时，表明有RNA污染。污染。2)小于小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小于小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：注：可能可能出现既含蛋白质又含出现既含蛋白质又含RNA的的DNA溶液比值为溶液比值为1.8的情况。的情况。测定结果分析测定结果分析B B：测：测RNARNA 纯的纯的RNARNA样品其样品其OD260OD260OD280OD280应介于应介于1.7-2.01.7-2.0之之间，间，OD260/OD230OD260/OD230比值应大于比值应大于2.02.0。1 1）若）若RNARNA样品样品OD260/OD280OD260/OD280比值太小，说明有蛋比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；白质或酚的污染；2 2）比值大于）比值大于2.02.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；时，可能被异硫氰酸胍等污染；3 3）OD260/OD230OD260/OD230比值小于比值小于2.02.0时表明有小分子及时表明有小分子及盐存在。盐存在。如果如果DNADNA和和RNARNA的量很少或有较多杂质的情况的量很少或有较多杂质的情况下，其含量可用溴乙锭荧光法测定。下，其含量可用溴乙锭荧光法测定。原理：原理：DNADNA、RNARNA本身并不产生荧光，但在荧光染本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭料溴乙锭(EB)(EB)嵌入碱基平面之间后，嵌入碱基平面之间后，DNADNA样品在样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNADNA溶液作标准对照，可比较出被测溶液作标准对照，可比较出被测DNADNA溶液浓度。溶液浓度。注意：注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。此法的比较主要基于目测，是估计水平。Home1 1 对对DNADNA 保存：保存：DNADNA样品溶于样品溶于pH8.0pH8.0的的TETE，4 4 或或-20-20 保存；保存；长期保存样品中可加入长期保存样品中可加入1 1滴氯仿。滴氯仿。2 2 对对RNA RNA 保存：保存：RNARNA样品溶于样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)0.3 mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，或双蒸灭菌水中，-70-70 保存保存;长期保存可长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中以沉淀形式贮于乙醇中;在在RNARNA溶液中，加溶液中，加1 1滴滴0.2 mol/L VRC(0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物)冻贮于冻贮于-70,70,可保存数年。可保存数年。