植物生理学论文

干旱胁迫对植物生理生化指标的影响 云南师范大学 生命科学学院 应用生物教育 B 班 摘要：干旱胁迫严重影响植物的生长、发育和繁殖等生命活 动,也是人们研究最多的逆境因子之一。干旱胁迫影响植物的 形态结构和生理功能。植物生物量、用水效率、光合系统、 渗透调节能力、细胞膜的稳定性、抗氧化系统的防御能力及 激素水平等指标的变化 ,常被用来判断植物抵御干旱胁迫的 能力。该文以小麦幼苗为实验材料，研究了干旱胁迫对小麦 种子的发芽率，小麦幼苗中脯氨酸、丙二醛（MDA）、过氧化氢、抗氧化酶（POD、PPO）、GSH、ASA含量的影响。关键词：干旱胁迫、小麦幼苗、生理生化指标Abstract ： Severe drought stress can effects the development and reproduction of plants and other life activities, therefore people study it largely. drought stress effects morphology and physiological functions of plants. Plant biomass, water use efficiency, photosynthetic systems, osmotic adjustment ability, changes in stability and defense capabilities, and hormone levels, such as the cell membrane antioxidant system indicators, often be used to determine the ability of plants that withstand drought stress. In this paper wheat seedlings are acted as experimental materials to study drought stress on wheat seed germination, seedling wheat proline, malondialdehyde (MDA), hydrogen peroxide, antioxidant enzymes (POD, PPO), GSH, ASA content.Key words: drought stress, wheat seedling,the standard of physiological and biochemica1.引言：植物常遭受的有害影响之一是缺水，当植物耗水大于 吸水时，就使组织内水分亏缺。过度水分亏缺的现象，称为 干旱。干旱可分为大气干旱和土壤干旱。大气干旱如果长期 存在，会引起土壤干旱。土壤干旱时，植物生长困难或完全 停止，受害情况比大气干旱严重。我国西北、华北和东北的 某些地区有土壤干旱。我国农业每年受旱灾面积达 2500 多 万平房千米。小麦是我国北方地区的主要粮食作物，但是近 几年随着气候的变化，小麦产量安全问题日益突出。小麦的 生长不仅受到自身遗传物质的控制，还受到众多环境因子的 影响，如光、温、水和土壤营养物质等，而小麦生育后期干 旱常常是限制我国北方地区小麦生长和发育的两个主要环 境胁迫因子。干旱对小麦的生理、生化都产生重要的影响， 进而影响小麦的生长发育、产量和品质。干旱对植物的影响：植物在水分亏缺严重时，幼叶向老 叶夺水，促使老叶死亡和脱落；胚胎组织把水分分配到成熟 部位的细胞中去，使小穗数和小花数减少；灌浆时缺水，籽 粒就不饱满，影响产量。其次，缺水时，正常的膜双层结构 被破坏，出现孔隙，会渗出大量溶质，膜的选择透性丧失， 膜上的酶活性也丧失，因此造成代谢紊乱。水对光合作用是 必不可少的，缺水会导致光合作用速率下降。最后由于溶质 累积，而使渗透势下降。参与渗透调节的物质有两大类：一 类是无机离子（尤其是钾离子），二是细胞内合成的有机物。 其中，高等植物中的渗透调节物质脯氨酸和甜菜碱，其中脯 氨酸在抗旱性中起重要的作用。在正常情况下，脯氨酸含量 总是很低，但一遇到干旱或盐渍，脯氨酸含量可增加数十倍。 所以测定植物脯氨酸含量是验证干旱胁迫对植物生理生化 指标的影响的方法之一，此外，还可以通过测定干旱植物和 正常植物体内的MDA、过氧化氢、抗氧化酶、GSH、ASA含 量来验证干旱胁迫对植物生理生化指标的影响。已经证明了在逆境条件下脯氨酸的积累来抵抗植物对 非生物胁迫的伤害，植物体内的抗氧化酶系统也能将伤害细 胞的活性氧控制在可忍耐水平内，通过各种过氧化酶的协同 作用，可以把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧如O2-、H2O2、OH-等直接或间接地清除，防止了活性氧放大级联作用，保证了细胞内生命活动的正常进行。丙二醛（MDA） 是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜 脂质发生过氧化反应而产生的，对干旱也具有抵抗作用。GSH 作为生物体内主要的还原态硫之一，在生物体抵抗各种 胁迫（冷害、干旱、重金属、真菌等 ）的过程中起着重要的作 用，其含量水平的高低与植物对各种环境胁迫的忍耐程度密 切相关。近些年来，它在高等植物代谢过程中的生理作用， 尤其是在植物抵御活性氧伤害过程中的作用及其与植物抗 逆性关系的研究进展很快。前人研究进展植物在正常生长情 况下, 活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。当植物在逆 境条件下（ 如干旱胁迫） 生长时, 这种平衡被打破 , 体内负 责清除活性氧的抗氧化系统能力下降 , 从而造成活性氧的大 量积累, 并引发或加剧膜脂过氧化作用 , 导致生物膜系统受 损。过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO ）、过氧化物 GSH（谷胱甘肽）等能够有效地清除这些自由基，是酶促防御 系统的重要组成成分。干旱对小麦的生理、生化都产生重要的影响，进而影响 小麦的生长发育、产量和品质。因此，为了减小环境对小麦 生产的影响，有必要从小麦的各项生理生化指标含量的变 化，来研究干旱胁迫对小麦的影响，从而找到合适的方法来 解决干旱胁迫问题，解决小麦生产安全问题提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料培养和处理1.1.1 种子发芽率的测定的材料培养和处理小麦种子吸胀12h后即可用于实验。1.1.2 余下实验材料培养和处理小麦种子吸胀12h，在湿润滤纸上培养7天，正常组即对照组继续正常培养，干旱组即实验组再干旱处理五天后用 于实验。1.2 测定方法1.2.1 种子发芽率的测定 所采用的种子发芽率的测定方法是曙红染色法和 TTC 染色法。凡是有生命活力的种子胚部，在呼吸作用过程中都 有氧化还原反应，而无生命活力的种子胚则无此反应。当 TTC 渗入种胚 的活细胞内，并作 为氢受体被脱 氢辅酶（NADH2或NADPH2）上的氢还原时，便由无色的TTC变 为红色的TTF【8】。用曙红染色的，凡是全部着色或胚已着色 的种子表示失去了生活力,播后不能发芽，生活力强的种子是 不会着色的,因为活细胞具有半透性膜,可防止染料分子通过 而不着色，死亡细胞 ,其壁膜失去半透性,染料分子易进入,使 原生质着色。各取50粒吸胀的小麦种子一沿胚的中心线切成两半（严格 区分两个半粒），进行下列实验：其中50 个半粒进行 TTC 染 色（30C水浴20 min）;另50个半粒进行曙红染色（室温 染色10 min）。根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。1.2.2 脯氨酸含量的测定 用茚三酮法测定脯氨酸含量，在酸性条件下，茚三酮与 脯氨酸反应生成红色化合物，在520nm下有最大吸收值。分 别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘一加入3 mL 3%磺基水 杨酸（SSA）和少许石英砂f充分研磨f用2 mL 3% SSA洗 研钵f5000 rpm离心10 min f上清液定容至5 mL。上清液 各2 mL f分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂f煮沸 15 minf冷却后f5000 rpm离心10 min f分别测定A520。1.2.3 MDA 含量 用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量【18】。分别取0.1 g实验组和对照组f加入 3 mL 50mM PBS （pH=7.8）和少许石英砂f充分研磨f用2 mL PBS洗研钵f 5000 rpm离心10 min f上清液定容至5 mL。测定：分别取上清液各2 mL f加入0.6%TBA（用0.6% TCA 配制）2 mLf煮沸12 minf冷却后f5000 rpm离心10 min f分别测定OD450和OD532.计算公式：OD450=C1X85.4OD = C X 7.4+155000 X C53212求解方程得： C1/（mmol/L） =11.71 OD450C2/（ mol/L） =6.45 OD532- 0.56OD450，式中，C1 为可溶性糖 的浓度，C2为MDA的浓度。1.2.4 H2O2含量测定用Ti（SO4）2法测定HO含量。H2O2提取:分别取0.5 g实验组和对照组f加入3 mL 50 mM PBS （pH=6.8，内含ImM HA）和少许石英砂f充分研磨 f用2 mL PBS洗研钵f5000 rpm离心10 min f上清液定容 至 5 mL。测定：分别取上清液各 3 mL f加入0.1%Ti（SO4）2 用 20%（v/v） H2SO4 配制1 mL f 摇匀f 5000 rpm 离心 10 min f OD410计算公式：H2O2 content = 九。xV x % （mmol.g-lFW） 宀Lx W显#用1.2.5 抗氧化酶活性的测定用愈创木酚法测定 POD 活性，用邻苯二酚法测定 PPO 活性。在有过氧化氢存在的条件下过氧化物酶能使愈创木酚 氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量其含量，进而 计算 POD 的活性。多酚氧化酶能使邻苯二酚氧化生成醌， 用比色法测量其产物的形成，进而计算出 PPO 的活性。POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H202，用PBS溶解）3. 00 ml，加入酶液100 ml （空白调零用 PBS 取代），立即记时，摇匀，读出反应 3 min 时的 A470。 PPO 测定：取 PPO 反应混合液（ 20mmol/L 邻苯二酚，用 PBS 溶解）2.8 ml，加入酶液0.2 ml （空白调零用PBS取代）， 立即记时，摇匀，读出反应 2 min 时的 A410。计 算 公 式 ： POD activities =A470 xv显x些（mmol. g-1FWmin-1）s x L x t V用PPO activities = A410总（U.g-iFW）x i, i0.01 x w x t V用1.2.6 GSH（谷胱甘肽）的含量测定用 DTNB 法测定 GSH 含量于 Ellman 试剂5， 5二硫 双（2硝基苯甲酸），DTNB与巯基的反应【】作为巯基定量 检测的方法， DTNB 在 pH=80 的条件下与巯基反应，生 成黄色物质在 412nm 处有强烈的吸收峰，根据吸光值的大小 即可求得试样中的巯基含量。分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘f加入3 mL 5%三氯 乙酸（TCA）和少许石英砂f充分研磨f用2 mL 5% TCA洗 研钵f 5000 rpm离心10 min f上清液定容至5 mL。 测定：上清液各1 mL f 分别加入 1 mL0.1M PBS （pH=7.7） f 0.5 mL 4 mM DTNB （用 0.1M pH6.8PBS 现配，空白用此 PBS 代替）f 25 C5 minf 测定 A412.计算公式：GSH content= A4】2 x皿 x v总（口 mol.g-iFW） X L x WV用1.2.7ASA的提取分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘f加入3 mL 5% 三氯乙酸（TCA）和少许石英砂f充分研磨f用2 mL 5% TCA洗研钵f 5000 rpm离心10 min f量上清液体积。测定：上清液各0.8 mL （空白用5% TCA代替）f 分别加入 0.8 mL 0.15 M NaH2PO4 （pH=7.4）和蒸馏水f 摇匀 f 分 别加入0.8 mL 5% TCA、44%磷酸和4%联吡啶 f 摇匀 f 加入 3%FeCl3 0.8 mL f 37 C 15 min f 测定 A525 计算：AVASA content x W X % X y总(叩。1 qFW)用2 结果与分析2.1 种子发芽率的测定TTC法结果：50粒具有生命活力。曙红染色法结果：48 粒具有生命活力。分别计算两种方法的发芽率： TTC 法中，5050=100%；曙 红染色法中，4850=96%。2.2 脯氨酸含量的测定实验组： A520=2.904A, 对照组： A520=0.263A，计算公式：Pro content= A520 x卩显xY总(卩 mol.g-iFW),其 x L x Wv用中 ， V 显 =6ml ， V 总 =5ml ， V 用 =2ml ， 520=3.24 卩 mol-1.cm-1,L=lcm,W=0.1g.计算结果：实验组脯氨酸含量为134.444卩mol.g-1FW，对照 组脯氨酸含量为12.176卩mol. F g-1W.2.3MDA 含量的测定测得的结果如下表所示OD450OD532实验组0.272 A0.076 A对照组0.096 A0.143 A最后计算得出浓度如下表：实验组对照组C/（ mmol/L）3.3180. 330C2/（卩 mol/L）0.1310.3882.4 H2O2含量的测定计算结果如下：A410H2O2含量（卩 mol.g-1FW ）实验组0.914A194.303对照组0.513A109.0562.5 抗氧化酶活性的测定实 验组：A410=0.867A , A470=2.490A ,对 照组： A410=0.647A， A470=1.170A。8410=0.28m/M*cm, 8470=26.6 m/M*cm, POD 测定：V 实验 显=4lml,V总=5ml,V用=3ml。PPO测定：V对照显=46ml,V 总=5ml,V 用=3ml代入计算公式得，POD活性：实验组为69. 169 Ug-lFW，对照组为44.068Ug-1FWPPO活性：实验组为7.168X10-4 mmolg-1FWmin-1，对照组 为 3.828X 10-4 mmol.gTFWminT。2.6GSH（谷胱甘肽）的含量测定实验结果如下表所示A412GSH含量(卩 mol.g-1FW )实验组0.291A1.570对照组0.226A1.3022.7ASA 含量的测定A525ASA含量(卩 mol.g-1FW)实验组0.182A0.919对照组0.136A0.6873.讨论与结论3.1 结论3.1.1 种子发芽率的测定 用两种方法测得的种子发芽率是不一样的， TTC 法为 100%，曙红染色法为 96%，证明这一批种子的生命活力较高。 两种方法测得的发芽率不同，可能是因为数的时候数错了。3.1.2 脯氨酸含量的测定计算结果为实验组脯氨酸含量为134.444卩mol.g-iFW, 对照组脯氨酸含量为12.176卩mol.gJFW。通过实验组与对照 组比较，可以看出实验组的脯氨酸含量比对照组大很多，增 加了有 11 倍左右。3.1.3 MDA 含量的测定随干旱程度的加剧，MDA的含量呈现上升趋势，与对照 组相比较干旱胁迫下的 MDA 含量也是有较大的上升。结合 我们的实验数据域，说明在干旱条件下， MDA 含量升高有 利于抵抗干旱胁迫。3.1.4 H2O2 含量我们的实验结果为实验组的H2O2含量为194.303 mmol.g-1FW，对照组的为109.056mmol.g-1FW。目前已有研 究表明，H2O2是生物体内的一种活性氧(ROS)，是细胞有氧 代谢的产物,在各种胁迫下产生量增加与CK相比，两干旱胁迫 处理的活性氧超氧阴离子(O 2-)和过氧化氢(H2O2 )逐渐积累 说明在干旱胁迫细胞有氧代谢加快，H2O2含量增加显著。3.5 抗氧化酶的测定本实验表明在干旱胁迫下，植物体内的抗氧化酶系统也 能将伤害细胞的活性氧控制在可忍耐水平内，通过各种过氧 化酶的协同作用，可以把细胞内产生的具有很强氧化活性的 活性氧如O2-、H2O2、OH-等直接或间接地清除，防止了活 性氧放大级联作用，保证了细胞内生命活动的正常进行。3.6GSH 的测定GSH 作为生物体内主要的还原态硫之一，在生物体抵抗 干旱胁迫的过程中起着重要的作用。实验组的含量比对照组 的高，说明干旱会使植物体内的 GSH 增加。3.7ASA 的测定实验组的含量比对照组的高，说明干旱会使植物体内的ASA 增加。3.2 讨论提取植物叶绿素时，研磨的不够充分，速度也不快，导 致实验结果不准确，因此，应该加大研磨速度。另外，用移 液管量取试剂时，读数不够准确，同样也会影响实验结果， 冲洗研钵时也存在洗不干净这样的问题。对这些问题，我们 应该仔细冲洗研钵，读数时视线与移液管相平，平时多练习 移液管的使用等。在做 POD、PPO 的测定时，由于操作太慢 而反应又进行的太快，所以测出的读数非常不准确，与理论 存在很大的差异。最后，对紫外分光光度计的使用也存在很 大问题，导致读数有误差，因此，应该学会熟练的使用紫外 分光光度计。综上所述这些原因都造成了实验结果的误差。参考文献【1】刘祖祺, 等. 植物抗性生理学 M. 北京: 中国农业出 版社, 1994. 84-195.【2】吕庆, 郑荣梁. 干旱及活性氧引起小麦膜脂过氧化与脱【3】嚨征的aj新正培)等閔胁迫对3麦生理生 【 4】张志良，瞿伟菁，李小方等。植物生理学实验指导，高等教育出版社，2009.75】薛卫巍，翟秋梅，薛永常，等罗布麻微生物脱胶工艺优化纺织学报，2009，30(4)：55-59【6】陈培元.作物对干旱逆境的反应和适应A吴向钰， 植物生理补充教材纪念56年教学研讨会40周年 C . 中国植物生理学会, 1996,46122。7】张殿忠，等.测定小麦游离脯氨酸含量的方法.植物生理 学通讯， 1990，(4)：62-65.8】王娟, 李德全. 水分胁迫下植物体内的抗氧化剂及其作 用 J . 生物学通报, 2002 .【10】陈少裕.膜脂过氧化对植物细胞的伤害J.植物生理 学通讯, 1991,27(2): 84-90.【11】张立军，魏 颖，等.H2O2信号在植物理化胁迫反应中的 作用.辽宁农业科学 2008(2): 3337【 12】孙侨南. 旱胁迫对黄瓜幼苗光合特性及活性氧代谢的影响.2008.