EASYspin Plus 植物RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

版本号:160120EASYspin Plus Plant RNA KitEASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒目录号：RN38 适用范围：适用于快速提取植物组织细胞总RNA，使用独有基因组DNA清除柱技术可有效清除电泳可见gDNA残留，RNA可用于反转录PCR，荧光定量PCR等。 试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存50 次(RN3802)裂解液RLT室温50 ml裂解液CLB室温8 ml裂解液RLT Plus室温25 ml去蛋白液RW1室温40 ml漂洗液 RW室温10 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇RNase-free H2)室温10 mlPLANTaid室温5 ml基因组DNA清除柱和收隼管室温50套RNase-free吸附柱RA和收集管室温50套本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。储存事项：1. 不合适的储存于低温(4C或者一20C )会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运 输和储存均在室温下(15C25C)进行。2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 注意事项1. 所有的离心步骤均可在室温完成（4C离心也可以），使用转速可以达到13,000 rpm 的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。2. 需要自备乙醇，研钵（可选）。3. 样品处理量绝对不要超过基因组清除柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造 成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量 时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。4. 裂解液RLT和RLTPlus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手 套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理 盐水冲洗。5. 关于DNA的微量残留：一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本公司的EASYspin Plus RNA提取产品， 由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已 经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别 特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧 光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：1）选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与 扩增反应。2）选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。3）将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后 的RNA清洁（cleanup），请联系我们索取具体操作说明书。4）在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I柱上消化处理。购 买DNA酶柱上消化试剂盒（货号：RN34）前可先索取具体操作说明书。6. 仔细阅读补充说明2,如果裂解液CLB效果好，可以联系我们单独订购裂解液 CLB。以后可直接订购RN53 EASYspin Plus多糖多酚复杂植物RNA快速提取试 剂盒。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇！1. 直接研磨法（提取简单植物样品推荐此法，但是简单样品也可以用液氮研磨法）:a. 新鲜植物组织称重后取lOOmg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保 存样品可直接称重后取lOOmg放入研钵），加入10体积（1ml） RLT和1体积（100回）PLANTaid室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解 液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。注：PLANTaid是提取多糖多酚次级代谢产物色素含量丰富的困难样品不可缺少 成分。b. 将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13, OOOrpm离心5-10分钟，沉 淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的 PLANTaid。c. 取4800裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多 的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇 （0.5 体积），此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。d. 立刻接操作步骤的步骤 3。2. 液氮研磨法（提取复杂，易降解样品时推荐此法） :a. 取500皿裂解液RLT，转入1.5ml离心管中，加入50皿PLANTaid混匀备用。b. 液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取 50mg 细粉转入上述装有 RLT 和 PLANTaid的离心管，立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。c. 用吸头吹打混匀帮助裂解或者剧烈涡旋震荡直到得到满意匀浆结果 （或者电 动匀浆30秒），可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。d. 将裂解物13,000 rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚 的 PLANTaid。e. 取裂解物上清（在不超过基因组 DNA 清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量） 转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇（0.5 体积），此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程，立即吹打混匀,不要离心。f. 立刻接操作步骤的步骤 3。注意：以上液氮研磨法用户可以根据需要加倍处理，可以提高产量。也就是使用1ml的裂解液RLT和lOOpl PLANTaid和100mg的样品。3. 将混合物（每次小于720皿，多可以分两次加入）加入一个基因组清除柱中，（清除 柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心 时间。4. 将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内（不用RNAse free或者DEPC 处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管）， 在基因组清除柱内加500皿裂解液RLTPlus，13,000 rpm离心30秒，收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450-500M左 右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5 倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉 淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。5. 立刻将混合物（每次小于720皿，多可以分两次加入）加入一个吸附柱RA中，（吸 附柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心 时间。6. 加700皿去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm离心30秒，弃掉废液。7. 加入500皿漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!）13,000 rpm离心30秒， 弃掉废液。加入500皿漂洗液RW,重复一遍。8. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免 漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。9. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的 中间部位加30-50皿RNase free water （事先在70-90C水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟， 12,000 rpm 离心1分钟。10. 如果预期RNA产量30昭，加30-50皿RNase free water重复步骤9，合并两次洗 液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍 （如果需要 RNA 浓度 高）。洗脱两遍的 RNA 洗脱液浓度高 ,分两次洗脱合并洗脱液的 RNA 产量比前者高 15 30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。补充说明 1：一般植物种类非常复杂，不同的植物种类和部位的样品使用本试剂盒（RN38 EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒）效果不同。部分的样品在经过基因 组DNA清除柱清除残留DNA的同时可能会严重降低产量。该种情况下，建议客户可 以尝试按照RN09 EASYspin植物RNA快速提取试剂盒的操作步骤进行提取。略去基 因组DNA清除柱子的步骤。RN09和RN38相比少一个基因组DNA清除柱的步骤， 部分情况下可能会提高产量。如果RN09提高产量的同时DNA残留也增多的情况下， 客户可以根据实验需要加一个DNA酶柱上消化的步骤（货号:RN34）来清除残留DNA 或者用传统的DNA酶消化来清除DNA残留。附录1： RN09 EASYspin植物RNA快速提取试剂盒操作步骤RN09 EASYspin植物RNA快速提取试剂盒和RN38 EASYspin Plus植物RNA快 速提取试剂盒的操作完全相同，就是省略了步骤3和4，在步骤1和2后直接接步骤5。 也可以找我们索取RN09 EASYspin植物RNA快速提取试剂盒详细说明书或者公司的补充说明2：有一些特别复杂的样品使用裂解液RLT提取失败或者产量很低想提高产 量的情况下，可以尝试使用裂解液CLB,裂解液CLB是本公司最新研发配方，测试 的松针、丹参叶、胡杨叶、番茄叶表明可以提高产量一倍甚至数倍。附录2： RN38 EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒使用新裂解液CLB操作步骤O 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇！O 取lml裂解液CLB至离心管内（如果CLB有析出或者沉淀需先置于65 C水浴重 新溶解），在裂解液CLB中加入5%卩-巯基乙醇（1ml CLB加50皿卩-巯基乙醇）。 颠倒混匀后65 C水浴中预热。1. 液氮中研磨新鲜或-70 C 冷冻的材料至细粉。2. 转移100-150mg细粉（水分少的样品如种子叶片等可加100mg，水分多的样品如 西瓜可多加一些）加至预热的裂解液CLB （已加有B-巯基乙醇）离心管中，立即 激烈涡旋3060秒或者用吸头吹打混匀裂解，短时放回65 C水浴中（5 min-10 min,时间稍长一点10分钟产量可能提高一些），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。B-巯基乙醇是裂解液CLB的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10-20%。3. 振荡混匀后室温13,000rpm离心10分钟。4. 取裂解物上清（在不超过基因组 DNA 清除柱能力的情况下可以取更多的上清， 这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇（0.5体积）， 此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。 若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。5. 立刻接操作步骤的步骤3。附录3:使用RN38 EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒和RN09 EASYspin植物RNA快速提取试剂盒发表的部分文章已经超过130篇：1. 桃 果实、花 、根、 叶： Isolation, characterisation and phylogenetic analysis of resistance gene analogues in a wild species of peach (Prunus kansuensis).Canadian Journal of Plant Science, 2011, 91(6): 961-9702. 樱桃花、叶、颚等各部位： Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early floweri.Journal of Plant Physiology, 2012,Available online 1 December 20123. 洋葱根、茎、蕾、叶、雌雄蕊等各部位：Cloning and Expression Analysis of A Putative B Class MADS-box Gene of AcPI in Onion. 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