APG平均聚合度的测定

烷基多糖苷APG平均聚合度的测定和预测摘要：烷基多糖苷是由葡萄糖和脂肪醇通过Fischer反应制得的。与自由的葡萄糖分子和脂肪醇反应产生 APG 相比, 在相同的条件下,产生的单葡萄糖苷分子可以使生成 APG 的反应进一步地进行。目前, 对 APG 平均聚合度PD的测定还没有简单且适用的方法。文中建议使用气相层析的方法来测定APG的PD值。可 以使用Flory聚合模型来计算PD值，但这需要对单葡萄糖苷和未反应的脂肪醇的摩尔分数进行实验性的评 价。对于反应而言, 葡萄糖分子中真正具有的活性中心的个数是一个关键的参数, 要通过对文献数据进行充 分地分析后才能得到这个参数值。实验结果表明， 葡萄糖分子是一个具有双重功能作用的分子。动力学模 拟实验支持了上述的说法。关键词：APG;气体层析；聚合；动力学；计算机模拟1.前言烷基多糖苷（APG）是由可再生的原料葡萄糖和脂肪醇通过Fischer反应精 制而成的，具有表面张力活性的混合物，其得到工业化规模的生产还不到二十年， 但是在Fischer糖基化中，它们的酸起催化作用在一个世纪以前就被发现了。 葡萄糖与过量的醇主要生成单葡萄糖苷，并拌有少量的双聚、三聚甚至更高聚的 葡萄糖苷生成。最终生成物的构成是由多种反应竞争的结果决定的（图 1）。第 一步是糖的质子化过程，使葡萄糖分子在缩水过后形成离子的形式 2。然后， 它与脂肪醇反应产生烷基葡萄糖苷。活化了的糖也能与生成的葡萄糖苷分子反应 形成低聚葡萄糖苷。葡萄糖低聚物能够被激化，从而能与脂肪醇或其它的低聚物 反应；与后者的反应可能是烷基化反应，也有可能不是这种情况。最终生成的混 合物的构成是非常复杂的，因为每一个葡萄糖苷可以以四种相互可变的形式存在 （两种半乳呋喃糖苷与两种半乳吡喃糖苷）。加之，在低聚的葡萄糖中，连在一 起的两个糖单元可以有不同的结合方式3。一个双聚的葡萄糖苷大约有30 种的 存在形式，而对于一个三聚和四聚的葡萄糖苷而言，分别有上百种和上千种的存 在形式。产物的分布情况可以用平均聚合度 PD 来描述， PD 的定义就是来自于 各种低聚物的摩尔分数Ni,其中i表示低聚物的种类以及每个葡萄糖苷分子中包 含的葡萄糖单元的个数。PD=NX1+N2 X2+N3X3+f n x i(1)只有通过高温气相层析（HTGC）技术才能够对烷基葡萄糖单苷和低聚烷基 葡萄糖苷混合物进行全面地分析4。HTGC技术可以应用于从低聚烷基葡萄糖 苷一直到十七烷基葡萄糖苷的分析。然而，由于生成物在反应中都呈现出了种类 多且单种类生成量少的特点以及缺乏必要的校准物质，限制了 HTGC 技术在实 际中的应用。一个标准物质必须是仅仅包含属于一个单一的低聚物具有的官能团 这样的物质，因此很难得到这些标准物。也存在其它测定PD的方法，它们主要 是通过对羟基官能团的数量以及对分子质量的测定而获得的 5。这些间接的测 定方法对样品的纯度要求非常高，并且样品纯度的精确性仍然不能证实。在这里， 我们报道了一种可靠、实用的测定APG平均聚合度PD的方法。2 实验部分2.1 原料GPC岛津GC-14B，体积12QC5/B 1.10：内部直径0.53mm,厚度1pm,长 度12m，载气：氦气，检测器:FID2.2烷基单葡萄糖苷和醇的分析测定2.2.1 样品的制备用10ml吡啶把产物（200mg）， 1 -二十二醇（130mg）和D （一）-甘露 糖醇（50mg，溶解在一个50ml的长颈瓶中。再加入3ml六甲基二硅氮烷和2ml 三甲基氯硅烷。在室温下放置10分钟，然后在50C下减压蒸发出吡啶。把剩余 的残余物溶解在8ml的三丁基-甲基乙醚中，然后过滤。最后得到的溶液供分析 测定用。2.2.2 方案注射液：0.5pl，带有温度程序控制器的烤箱：150c（5min），150-300C （4c/min）， 300C（15min），注射器：300c，检测器:340C。分析产品的保留时间列于表1 中。表 1. 烷基单糖苷和脂肪醇的保留时间表 2. 脂肪醇的保留时间 （ 在 ?APG 的提取之后 ）IR-etcfition tinier dF lilkil rnarrnglucixsiLJe-s nrad JhLLv nicolnak(silyl dhecRjzknLion li me- mm)letnid reyl rntxicg lncxisidx17.426.731 IgLoclerkl ijirKi|i lucusickHOclrelecjl in* in%l iktw iJe-s33.29L.JOqDocoj-.iii l 恨 f. Jbr-die 121. 17iriiiiiiilLKDiiJej)IHlndix即 niJ3.191 leLnclev nrKil7.SI()L：lnckxonalI.Z.39MunnilDl 価匸 fix CiLly .iloohili157Ijbk 2RetenLion lime of fnlLy .ikahdi ilnfLer hydralyshs .incI eilrncLicin of APG)AlcdiolRiknLhn lime mm)leimd：yrid5.BD11口 ndet:rirKil6.17OcIiKlennol畑IkpiodMinol (r-FJE.942.3 羟基和烷基多糖苷的分析2.3.1 羟基用30ml二甲基醚和5ml硫酸溶液(20%, w/w)把3g的APG和1g十七醇 溶解在一个250ml的长颈瓶中。溶液在1101下，回流加热6小时，然后冷却到 50r。把回流得到的溶液倒在一个500ml的分液漏斗中，再向分液漏斗中加入 30ml二乙醚和25ml水。把得到的混合物进行充分地摇荡，然后静置分层。保留 得到的有机层溶液，用25ml的二乙醚把溶剂层溶液提取三次；最后把4次得到 的有机溶液混合在一起，再经过干燥，最终得到的溶液供分析测定用。2.3.2 实验方案注射液：2pl,带有温度程序控制器的烤箱：100r (1min)，100-150C (10/min)， 150r (1min)，150-300C (20c/min)，300C (15min)，注射器：300c，检测 器: 340c。分析产品的保留时间列于表2中3. 低聚物分布情况的数学描述1952年Flory用数学模型描述了 i-聚合物摩尔分率分布的情况7。他首次把 数学模型应用到从多功能的单体合成聚合物上来。这种类型的单体分子带有一个 A 种类的单官能团和一、两个或更多几个 B 种类的官能团。缩合反应仅限于 A 和B官能团之间的反应。在这里，Flory引入了不发生分子内缩合反应的假设。 而且，对于一个给定种类的官能团，在反应的任何阶段都假设它具有相同的反应 活性。在这些假设条件下，给出了平均聚合度的计算公式如下：PD=1 (2)1 - a (f - 1)这里，a是指缩合了的B官能团所占的分数，/是指在单体分子中官能团(A和 B)的个数。另外一个重要的公式给出了包含x个单体单元的低聚物所占的摩尔 分数 NxxN =(fx-x )x摩尔分数N的特值N1可以表示为：XN1=(1-a)f-1( 4)这样 a写成了 N的函数，并把它代到等式(2)中可得:在N1和f已知的情况下，可以通过等式（6）计算PD的值。N1需要通过 大量的测量数据才能获得， f 是针对一定的研究条件下，化学反应系统的特征 参数。4. 应用于烷基糖苷低聚物参考文献中提到了用Flory模型来测定APG的PD值，但是没有清楚地 描述这个过程。需要解决的主要问题是，如何在现有的合成 APG 的条件下来 测定葡萄糖的功能性参数f的值。很显然，就Fischer糖基化反应来说，在葡萄 糖分子中，并不是所有端基异构的羟基官能团都具有相同的反应活性。通过对 烷基葡萄糖苷混合物 13C-NMR 的研究可以看到，有一半的葡萄糖单元是通过 1-4糖苷键相连的，其余的一半是通过1-6糖苷键相连的。只有少量的通过1-2 和 1-3 糖苷键相连的烷基葡萄糖苷能被检测出来。第一个可能的推断是：在糖 基化过程中，葡萄糖起着一个三功能性分子（f=3）的作用；非端基异构的羟 基官能团在Fischer模型中是以A种类官能团形式存在的，羟基官能团在位置 4和6时就成B种类形式。这个假设表明，在这些低聚物中存在着分支结构。 由此，等式（6）就成了：PD=1/（2N11/2-1）（7）假设B种类官能团所在的位置都具有相同的活性是不实际的。这样就会 出现一个极端的情况：在葡萄糖的 4（或 6）位置的反应将会完全抑制在葡萄 糖 6（或4）位置的反应。在这种情况下，葡萄糖分子表现出了具有两种截然 不同功能的分子（f=2）的性质，这里非端基异构的羟基官能团成了 A种类 的形式，在位置4 （或6）的羟基官能团成了 B种类的形式。在这些假设下， 形成的低聚物都是线形分子。把f=2代入（6）式中可以得到下面一个简单的PD=1/N1(8)R? Fl1 RIIECSWlRxnl FDJ - 2 闻.I7/ - 3(E)：ll l.rj-!s PDIMimLkm旳FJaryes PDlislkin ()EkniDlti ELS.7,24LID-3.3I.2I.-2.5Grilnin |9|耐1.25I.24-D.7I.25Q百Sdmk 677.9I.3D1说-I.3I.4I.QSBKkLD75.3,33I.33-QI.LJE23WuliT I.I.74.1.1.4DI.35-3.51.3.SiriKUi 1.274.31.4DI.35-3.fiua-l.lSdnuli 273.11.40I.37-2.1.I.39-Q9Knhrc |；|734141.I.39-I.SI.43I.6IZskucIxsri IJ|72.5,42ua-3.1.I.42aoBKkLD6?.l.1.50I.49I.574.2Smith | M|6R.01.57I.47一酣I.54-2.1lie.-.-： ir-i.6DI.46-9.DI.52-4.9Beck LD5931.71.1.阴-I.SI.35SkOHlvs ir-i5E.61.71.LTD-asI.S79 1IIlV5 1 IM55.1.1.921瓯-5.42.067.5BkLDM.S2.D4I.94-4.72.3U.SBecklLD巧屮2.IS2.1 a-0.22.K19.1Beck LD41.?241.142+0143.545.2Menu clei uiLiaii2.7Mlthi chi ijLiuii74由于 Flory 模型没有考虑到这个参数非整数值的情况，因此对这两个可 能的整数 f 值进行评价选择是必要的。这个参数的测定是依据已经发表的从 N1到Ng的实验数据得来的。它们可以通过等式（1）来计算真实的PD 值，并且也可以通过等式（7）或（8）来计算Flory模型的PD值。文献数据 和计算结果列于表 3 中。对通过由 Flory 计算出的 PD 值和真实的 PD 值之间 的平均误差而言，由f=2得到的PD值要比f=3得到的PD值的平均误差要小， 但是需要通过分析误差一PD之间依附的关系曲线才能得到更多的信息。高含 量的烷基单糖苷是与低的PD值联系在一起的，这时由f=2和f=3得到的两个 等式计算出的 PD 值和真实值都很吻合。当烷基单糖苷的含量降低的时候， 在f=2时，真实的PD值和Flory PD值之间的误差仍然较小，但是对于f=3 的情况，误差却大大地增加了。这种现象支持了葡萄糖分子是具有双功能反 应活性分子的假设。现在假设f=2, 种未知APG混合物的PD值可以通过（8）式来计算：PD=1/N1= （APG的mol分数）/（烷基单糖苷的mol数）（9）利用这个等式计算 PD 值需要两种分析测定的结果。烷基单糖苷的摩尔 数可以通过气相层析的方法很容易地测定。依据化学反应中精确的物料平衡 来测定 APG 的摩尔数是必要的。 Fischer 反应一向以产生侧链的反应而著称 2，10（糖的低聚反应，脱水反应，）得到的产物不具有分析性，但它们 仅限于包含糖 的分子。相反，脂肪醇链被保护了起来。由于消耗的脂肪醇是 按照一定的化学计量比给定的，因此，通过气相层析法对反应产物的含醇量 进行测定得到的APG总摩尔数，与反应前有大量的醇存在时得到的情况有所 不同。这样，在一个单一的注射孔中就可以对两种气相层析的结果进行分析， 使之评价一种APG混合物的PD值就成了一种可能。5. 计算机模拟由于存在着脂肪醇的糖基化反应与聚合反应之间的竞争，APG合成反应 的机理与 Flory 所理解的情况有一点区别。特别地对于我们的应用来说，对 Flory模型进行确认是必要的。然而，有人会认为根据Folry关于f的定义得 到的 f=2 的值的条件和目前所认为的不太一样。的确，葡萄糖分子表现为一 个三功能性的单体，在它上面一个B位置发生的反应将完全抑制在其它B处的反应。结果得到的低聚物是由？没有分支的分子组成的，而真正的 f=2 的 情况是与直的没有分支的分子联系在一起的。为了验证我们所采用的方法的 有效性，建立的化学反应动力学模型如下：对于每种反应物来说糖基化是一个带有部分反应次序的、不可逆的、具 有双功能性质的反应。对反应而言，一个非端基异构的羟基官能团（位置A）拥有一个固定的 速率常数，它不会受到产生它的分子性质的影响。葡萄糖被认为是一个具有三功能性质的分子，为了解决问题定义以下 5个速率常数：1. k0定义为A和脂肪醇反应的速率常数2. k1定义为A与第一类的一个B官能团的反应（葡萄糖中的位置6）速率 常数3. k2，象k1 一样，但属于第二类的B官能团（葡萄糖中的位置4）4. k12，象k1 一样，但它是等其它的B官能团已经反应过后，A再和脂肪醇 反应得到的值（假如f=2为0）5. k21，象k2 一样，但它是由其它的B官能团已经反应过后得到的值（假如 f=2 为 0）计算仅仅被限于单体单元的最大数量为m的聚合物。mol分数Nm 一定 比计算 PD 值时所要求的精确度低的多。主要模拟的参数量是 m， 5 个速率常数值，以及葡萄糖和脂肪醇的起始浓 度。其它的参数控制着动力学平衡的内部机能。对于一个模拟要求：列举出所有可能产生出的化学分子的种类。（一直到m-mers）。针对这种 情况精心编写一个关于 APG 分子计算机译码。列举出所有的能够潜在产生每种分子的基本化学反应式。对每个基本反应的速率常数的进行判别。利用四级R-K方程,来解答由反应物的起始浓度得到的相应的微分方程式。 当Ni值小于一个任意给定的小数值时，模拟将终止根据等式（1）来计算最终的 PD 值通过等式（7）和（8），由 N1 来计算理论的 PD 值表 4.利用定义和Flory模型（f=2得到的Eq.（7）和f=3得到的Eq.（8）得到PD值（Eq. （1）的比较。 利用计算机模拟得到的摩尔比 Ni。:-PD(Eq.(：l：lRD(Eq.(Tl：lPD Eq.愷 1)PD (Eq. (1RD Eq.TO 1. (E)：l2JQI.5QI.5Dua1.551.4-B1551I.561.应LeeI.CI.152M21百1嗣1.63I.7S1.701.7014I.7II.7I.UDI.HDIj66IEI1.2I.33I.332.I.D1.941.75宓用C语言编写相应的计算机程序。它需要编辑用的标准库数据，这可以 从作者那得到。解答微分方程式所用的数据可以从数据处方库中调入。在所 有的模拟中，参数都是任意给定的。葡萄糖的起始浓度被定在 1.0，醇糖基化 的比率常数k0为2.0。过量醇浓度的范围在1.2到2.0之间。对f=2和f=3的 情况，分别认为k1=k2=1,k12=k21=0,和k1=k2=k12=k21=1。在这些比率常数 中选择一个共同的参数，使它对脂肪醇反应活性的影响要比在葡萄糖的 4 和 6 位置反应活性的影响要大。通过表 4 中的结果可以清楚校验等式（7）和（8） 的有效性。这些计算支持了 Flory模型的说法，它对计算APG I-mer的总数 和测定N1以及允许通过f真实地测定PD值提供了正确的描述。其它的计算 数据（在这里没有给出）已经证实了在两个通过k1=k2=k,k12=k21=0 （弯链 聚合物）和k1=2k2,k2=k12=k21=0 （直链聚合物）定义的系统中，Ni开方值 都是一致的。这是因为当k1=k2的时，两个B组基团存在对称性的原因。6. 总结在计算机模拟的帮助下，我们研究了 Flory 模型是怎样对由葡萄糖和脂 肪醇的酸催化反应制取的APG的重新分配进行充分描述的。这个反应中，葡 萄糖起着一个双功能分子的作用。这是从葡萄糖分子存在双功能和三功能这 两个实际的假设中得到的。后者的理论被推翻了，这是因为它不符合 Flory 模型所的在PD和烷基单糖苷的mol分率N之间的一个特定的关系。这个结 果可以通过分析文献数据得到，在文献数据中可以得到不同种类的I-mers的 mol分率的分配情况。从Flory模型和葡萄糖作为双功能分子的角度来看，可 以简单地把判断表示为N1的倒数。利用这个结果来计算APG的样品的PD 值，要求测量烷基单糖苷和烷基多糖苷的mol数，这两个都需要通过GC技 术来获得。感谢感谢de la Marne （法国）的资金支持和K.Ple在文章语言上给予的建议。参考文献（略）