双缩脲测多肽含量

双缩脲反应双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比， 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提 供碱性环境，因此它可被其他碱,如氢氧化钠所代替。向试剂中加入 碘化钾，可延长试剂的使用寿命。双缩脲法（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3 ）是两个分子脲经180C左右加热， 放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连 接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩 脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量 及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨 基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以 及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快 速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（ BSA） 或标准酪蛋白，配制成 10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用 BSA 浓度 1mg/ml 的 A280 为 0.66 来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可 预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯 度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl 配制，酪蛋白用0.05N NaOH配制。（2）双缩脲试剂：1.50克硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0克酒石 酸钾钠（KNaC4HQ64H2O）,用500毫升水溶解，在搅拌下加入300 4462毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁 涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现， 则需要重新配制。参考文献： 发酵鱼粉中寡肽检测技术研究 【蛋 白水解液中多肽含量的测定方法】2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取 12 支试管分两组，分别加入 0， 0.2， 0.4，0.6， 0.8， 1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1 毫升，然后加入 4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（2025C）下放置30分钟， 于 540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空 白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收 值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取 23 个试管，用上述同样的方法，测定未知 样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过 10mg/ml。