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欢迎指导！新城中学明确学习目标明确学习目标n 简述简述动物动物细胞的培养细胞的培养过程过程n 举例说出举例说出细胞融合细胞融合和和单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备n 关注克隆技术的关注克隆技术的伦理伦理问题问题重点、难点、考点重点、难点、考点n 动物细胞的培养动物细胞的培养n 核移植与体细胞克隆核移植与体细胞克隆n 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备克隆羊克隆羊“多利多利”新华网2010.12.3.消息克隆羊多利重生 这4只克隆羊在遗传上与多莉毫无差异。多莉诞生于14年前，是第一个使用成熟细胞克隆的哺乳动物。克隆羊多莉(Dolly)已经获得“重生”。最初进行此项克隆研究的英国科学家又培育出4只克隆羊，被形象地称之为“Dollies”(多莉的复数)。它们是多莉的复制品，在遗传上与多莉丝毫不差，多莉在7年前离开这个世界。问题导学问题导学1、克隆羊、克隆羊“多利多利”的重生，采用的是什么的重生，采用的是什么技术？技术？细胞工程技术2、动物细胞工程技术到底是干啥的？（定义）、动物细胞工程技术到底是干啥的？（定义）在细胞生物学和分子生物学理论指导下，根在细胞生物学和分子生物学理论指导下，根据人类的需要一方面深入探索并改造生物的据人类的需要一方面深入探索并改造生物的遗传特性，另一方面应用工程技术手段，大遗传特性，另一方面应用工程技术手段，大量培养细胞。量培养细胞。动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体制备单克隆抗体制备体细胞克隆体细胞克隆细胞核移植细胞核移植动物动物细胞细胞工程工程技术技术动物细胞工程动物细胞工程的基础的基础范畴范畴动物细胞和组织培养动物细胞和组织培养在体外模拟动物体在体外模拟动物体内环境内环境，将动物体细胞或，将动物体细胞或组织，在组织，在无菌、温度适宜和营养充足无菌、温度适宜和营养充足条件下条件下培养，使其继续培养，使其继续生长、增值生长、增值并维持原有结构并维持原有结构和功能的技术。和功能的技术。讨论讨论1、动物细胞培养的原理是什么？、动物细胞培养的原理是什么？2、从动物机体中要取出哪些相关组织？并、从动物机体中要取出哪些相关组织？并解释原因。解释原因。3、组织分散成单个细胞的方法是什么？其、组织分散成单个细胞的方法是什么？其理论依据是什么？理论依据是什么？4、动物细胞体外培养需要满足哪些条件？、动物细胞体外培养需要满足哪些条件？动物细胞培养条件：动物细胞培养条件：1 1、无菌、无毒的环境：无菌、无毒的环境：（添加一定量的抗生素；定期更换培养液，以便清除代（添加一定量的抗生素；定期更换培养液，以便清除代谢产物。）谢产物。）2 2、营养物质、营养物质(区分天然培养基与合成培养基区分天然培养基与合成培养基)（无机盐、葡萄糖、氨基酸、核酸、维生素、动物血清等。无机盐、葡萄糖、氨基酸、核酸、维生素、动物血清等。）3 3、温度和温度和pHpH：3737,4 4、气体环境：气体环境：O O2 2和和COCO2 2（95%95%空气和空气和5%CO5%CO2 2 ）3.3.动动物物细细胞胞培培养养过过程：程：v用用胰蛋白酶等胰蛋白酶等处理动物组织，形成分散的处理动物组织，形成分散的悬浮细胞。动物细胞培养适宜的悬浮细胞。动物细胞培养适宜的pH为为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，）没有活性，而胰蛋白酶而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。的活性较高。说明：分散成单个动物细胞（细胞培养）说明：分散成单个动物细胞（细胞培养）动物细胞生长特性：动物细胞生长特性：n 细胞贴壁：细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。壁上，称为细胞贴壁。细胞的接触抑制细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。触抑制。思考：思考：细胞发生接触抑制后如何使细胞细胞发生接触抑制后如何使细胞继续分裂增殖？继续分裂增殖？原代培养原代培养：是指从供体获取是指从供体获取组织或细胞组织或细胞后的初次培养。后的初次培养。传代培养传代培养：将原代培养的细胞分离稀释后转入新的培将原代培养的细胞分离稀释后转入新的培养瓶中养瓶中继续培养继续培养，称为传代培养。，称为传代培养。动物胚胎或幼龄动物的组动物胚胎或幼龄动物的组织、器官织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系单个细胞单个细胞加培养液加培养液遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质已改变已改变动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）4.4.动物细胞培养过程：动物细胞培养过程：细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果大量获得细胞大量获得细胞或细胞产物或细胞产物快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的动物血清动物血清植物激素植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较动物细胞培养应用动物细胞培养应用n 大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）；大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）；n 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性；培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性；n 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。思考与探究：如何用细胞培养技术，为烧伤病人植皮？取该患者的皮肤进行取该患者的皮肤进行细胞培养细胞培养,获得足量的细获得足量的细胞后再移植胞后再移植动物细胞培养技术应用动物细胞培养技术应用这只老鼠身上的这只老鼠身上的“人耳人耳”是是由由我国我国科学家科学家曹谊林曹谊林教授利教授利用细胞工程技术复制出来的。用细胞工程技术复制出来的。器官克隆器官克隆一例一例小结基本概念小结基本概念原代培养：原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1 1代细胞与传代细胞与传1010代以内的细胞称为原代细胞培养。代以内的细胞称为原代细胞培养。传代培养：传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。细胞株：细胞株：原代细胞一般传至原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。特点，失去接触抑制，容易传代培养。细胞贴壁：细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快贴在瓶壁上，称为细胞贴壁。悬液中分散的细胞很快贴在瓶壁上，称为细胞贴壁。接触抑制：接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。分裂增殖的现象。测试一下测试一下n 1 1、在动物细胞培养过程中，出现遗传物质改变的、在动物细胞培养过程中，出现遗传物质改变的细胞是（细胞是（）n A A细胞系细胞系 B B细胞株细胞株 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞n 2 2、下列属于动物细胞培养与植物细胞培养区别的、下列属于动物细胞培养与植物细胞培养区别的是（是（）n A A培养基成分不同培养基成分不同n B B动物细胞培养不需要在无菌条件下进行动物细胞培养不需要在无菌条件下进行n C C动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能n D D动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株成植株动物动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。逐渐变弱。还不能用类似植物组织培养还不能用类似植物组织培养核移植核移植动物细胞核移植思考：动物细胞培养有没有发育成一个新个思考：动物细胞培养有没有发育成一个新个体？体？动物体细胞核移植概念动物体细胞核移植概念:将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新胚胎最终发育成动物个体。重组并发育成一个新的胚胎，这个新胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为用核移植的方法得到的动物称为克隆动物克隆动物核移植核移植胚胎胚胎细胞核移植细胞核移植体体细胞核移植细胞核移植（难度高难度高）受体细胞：去核受体细胞：去核卵细胞卵细胞原理：原理：动物体细胞核的全能性动物体细胞核的全能性动物克隆过程的动物克隆过程的实际实际是是细胞核移植细胞核移植克隆羊克隆羊“多利多利”的产生过程的产生过程:问题：1）、上述多利羊的成功培育过程表明了什么？也反映出了什么问题？.2）、书上说治疗性克隆和生殖性克隆的大讨论，你有何观点，请说出来。你认为生殖性克隆会带来哪些伦理上的问题？（发散思维）_。3）、克隆羊“多利”六岁就离开了这个世界，换了关节炎和肺病，这表明_，如果克隆人是否也存在健康隐患？_.5）、书上说：“克隆技术在克服动物种间杂交障碍，创造新物种等方面具有重要的科学意义和潜在的经济价值。”你如何理解？6）、你对克隆技术有哪些期望？（参考教材p57）思考题思考题、在进行体细胞核移植之前，为何要去掉受体卵母细、在进行体细胞核移植之前，为何要去掉受体卵母细胞的核？胞的核？为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。提供的细胞。、用于核移植的供体细胞一般都选用传代、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的代以内的细胞，为什么？细胞，为什么？1010代以内的细胞保持一般保持正常二倍体的核型，未突变代以内的细胞保持一般保持正常二倍体的核型，未突变3、细胞核移植生产的克隆动物是对体细胞供体动物进、细胞核移植生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了行了100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分不是，克隆动物绝大部分DNADNA来自供体细胞核，但核外来自供体细胞核，但核外还有少部分还有少部分DNADNA（如线粒体（如线粒体DNADNA）来自受体卵母细胞）来自受体卵母细胞4.4.动物克隆实例很多，为何多莉就举动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？世闻名呢？在在1997年年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊科研组公布体细胞克隆羊“多莉多莉”培育成功之前，培育成功之前，胚胎细胞核移植技术胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，已经有了很大的发展。实际上，“多莉多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低移植的全部过程，但这并不能减低“多莉多莉”的重大的重大意义，因为它是世界上意义，因为它是世界上第一例第一例经经体细胞核移植体细胞核移植出生出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物分化了的动物细胞核细胞核也具有也具有全能性全能性 克隆动物的研究意义克隆动物的研究意义1.1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白白2.2.改良动物品种改良动物品种 3.3.治疗人类疾病，作为供体治疗人类疾病，作为供体4.4.保护濒危动物保护濒危动物体细胞核移植技术存在的问题：体细胞核移植技术存在的问题：许多克隆动物表现出遗传和生理缺许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。困难，脏器缺陷，免疫失调等。布置作业布置作业n复习细胞培养过程及克隆动物过程n学案后的【巩固练习】n预习细胞融合与单克隆抗体的制备第二课时第二课时n 细胞融合细胞融合n 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备概念：（略）概念：（略）过程4 4、原理、原理细胞膜的流动性5 5、最有价值的应用、最有价值的应用制备单克隆抗体3 3、过程、过程不同DNA的两个细胞灭活的病毒PEG杂交细胞v 细胞融合完成的标志细胞融合完成的标志:细胞核融合成一个核细胞核融合成一个核显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株用途用途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振荡、电刺激）荡、电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合的方法细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性原理原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目、植物、动物细胞融合的比较、植物、动物细胞融合的比较一、何谓单克隆抗体？一、何谓单克隆抗体？只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。特点：产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏特点：产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏常规抗体制备常规抗体制备一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞：只分泌一种：只分泌一种特异性抗体特异性抗体单克隆抗体单克隆抗体杂交瘤细胞杂交瘤细胞 小鼠小鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞：能：能无限增殖无限增殖融合融合 单克隆抗体单克隆抗体 培养培养 向动物体内反复注射抗原，使动物产生抗体，然后从血清中分离向动物体内反复注射抗原，使动物产生抗体，然后从血清中分离所需抗体。所需抗体。制备过程：制备过程：v 一筛一筛v 二筛二筛提取提取用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基用专一抗体用专一抗体检验阳性检验阳性应用：应用：生物导弹1 1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓疤细胞融合的是（培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓疤细胞融合的是（）A.A.经过免疫的经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞 B.B.没经过免疫的没经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞C.C.经过免疫的经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 D.D.没经过免疫的淋巴细胞没经过免疫的淋巴细胞A2 2、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞 （）A.A.容易产生各种变异容易产生各种变异 B B具有更强的全能性具有更强的全能性C.C.取材十分方便取材十分方便 DD分裂增殖的能力强分裂增殖的能力强D3.3.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于()()A.A.培养基不同；培养基不同；B.B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。A4 4、动物细胞融合和植物原生质体融合比较，在动物细胞融合、动物细胞融合和植物原生质体融合比较，在动物细胞融合 中有特殊性的是（中有特殊性的是（）A A、融合的原理、融合的原理 B B、融合的优点、融合的优点 C C、融合的诱导手段、融合的诱导手段 DD、融合的过程、融合的过程5 5、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B B淋巴细胞诱导淋巴细胞诱导 融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞。在这种培融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞。在这种培 养基上不能存活、增殖的细胞是（养基上不能存活、增殖的细胞是（）B B淋巴细胞淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B B淋巴细胞自身融合细胞淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞A A、B B、C C、DD、C A7 7、(06(06江苏江苏)下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。（1 1）_技术是单克隆抗体技术的基础。技术是单克隆抗体技术的基础。（2 2）根据培养基的用途分类，图中）根据培养基的用途分类，图中HATHAT培养基属于培养基属于_培养基。培养基。（3 3）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是_。（4 4）动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采）动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采用用_。（5 5）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的_特点，又具备淋特点，又具备淋巴细胞的巴细胞的_特点。特点。（6 6）淋巴细胞是由动物体）淋巴细胞是由动物体_中的中的_细胞分化、发育而来。细胞分化、发育而来。（7 7）杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是）杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是_。动物细胞培养动物细胞培养选择选择特异性强特异性强,灵敏度高灵敏度高灭活的病毒灭活的病毒在体外大量增殖在体外大量增殖分泌特异性抗体分泌特异性抗体骨髓骨髓造血干细胞造血干细胞主动运输主动运输6、基因型为、基因型为AaBb的水稻的水稻(具有具有24条染色体条染色体)的花粉通过无菌操作，的花粉通过无菌操作，接入试管后，在一定条件下形成试管苗的育种过程。接入试管后，在一定条件下形成试管苗的育种过程。(1)愈伤组织是花粉细胞不断分裂后的形成的不规则细胞团，愈伤组愈伤组织是花粉细胞不断分裂后的形成的不规则细胞团，愈伤组织形成中，必须从培养基中获得织形成中，必须从培养基中获得_。(2)要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有_和和_两两类激素。类激素。(3)愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照，其原因是这一过程必须给予光照，其原因是_利用光照制造有利用光照制造有机物，供试管苗生长。机物，供试管苗生长。(4)试管苗的细胞核中含有试管苗的细胞核中含有_条脱氧核苷酸链。条脱氧核苷酸链。(5)培养出的试管基因型有培养出的试管基因型有 。如果要获得育种需。如果要获得育种需要的植株，并能繁殖新品种，后面的育种步骤是要的植株，并能繁殖新品种，后面的育种步骤是_。各种营养各种营养(水、无机盐、蔗糖等能量物质水、无机盐、蔗糖等能量物质)和小和小分子有机物分子有机物生长素、生长素、细胞分裂素细胞分裂素叶绿体叶绿体 24AB、Ab、ab、a用一定浓度的秋水仙素处理组织培养获得的幼苗用一定浓度的秋水仙素处理组织培养获得的幼苗
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