微生物的生长及影响因素.ppt

微生物的生长及影响因素,一、微生物的生长,个体生长：细胞体积增大，重量增加。 个体生长个体繁殖群体生长 除了特定的目的以外，在微生物的研究和应用中提到的“生长”，均指群体生长。,细菌的繁殖方式,Binary fission-growth cycle,二、微生物群体的生长规律,把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的条件下，它们的群体就会有规律的生长起来。以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就得到微生物的典型生长曲线。 根据微生物的生长速率常数R不同，可分为： Lag phase（延滞期、调整期、适应期） Exponential phase（指数期、对数期） Stationary phase（稳定期、平衡期） Death phase（衰亡期）,Growth cycle of populations in batch culture,1、延滞期,特点 生长速率常数R = 0 细胞形态变大或增长 细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈碱性。 合成代谢活跃，易产生诱导酶。 对外界不良条件反应敏感 影响因素： 菌种特性 接种龄 接种量 培养基成分,（1）接种龄的影响,接种龄：种子的群体生长年龄，即它处在生长曲线的哪一个阶段，这是一种生理年龄。 若以对数期接种龄的种子接种，则子代培养物的延滞期就短。 若以延滞期或衰亡期的种子接种，则子代培养物的延滞期就长。 若以稳定期的种子接种，则延滞期居中。,（2）接种量的影响,一般说来，接种量大，则延滞期短，因此，在发酵工业上，为缩短不利于提高发酵效率的延滞期，一般采用10%的接种量。,（3）培养基成分的影响,接种到营养丰富的天然培养基中的微生物，要比接种到营养单调的组分培养基中的延滞期短。 在发酵生产中，常使发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量接近。,2、对数生长期,特点： R最大，增代时间（代时G）或倍增时间最短。 细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀。 酶系活跃，代谢旺盛。 影响因素： 菌种特性 营养成分 营养物浓度 培养温度,（1）营养成分的影响,同一种细菌，在营养物丰富的培养基中生长，其代时较短，反之则长。,（2）营养物浓度的影响,在营养物浓度很低的情况下，营养物的浓度才会影响生长速率；随着营养物浓度的提高，生长速率不受影响，而只影响最终的菌体产量；进一步提高营养物浓度，则生长速率和菌体产量两者均不受影响。 凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物，称为生长限制因子。,（3）培养温度的影响,E.coli在不同温度下的代时 温度 代时（分） 温度 代时（分） 10 860 35 22 15 120 40 17.5 20 90 45 20 25 40 47.5 77 30 29,特征参数,繁殖代数 n： x2=x12n n = 3.322 (lgx2 lgx1) 生长速率常数 R：单位时间内的繁殖代数 R = n / (t2 t1) = 3.322 (lgx2 lgx1) / (t2 t1) 代时G：繁殖一代所需的时间 G = 1/ R = (t2 t1) / 3.322 (lgx2 lgx1),3、稳定期,特点： R = 0，菌体产量达到最高点（细胞繁殖数=死亡数）。 细胞开始储存糖原、异染颗粒和脂肪等储藏物。 以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期。 稳定期到来的原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调； 有害代谢产物累积； pH、氧化还原电势等物化条件不适宜。,4、衰亡期,特点： 个体死亡速度 新生速度，群体呈现负生长； 细胞形态多样； 细胞产生自溶； 产生或释放抗生素； 芽孢杆菌中芽孢的释放。 衰亡期到来原因： 环境条件越来越不利，从而引起细胞内分解代谢大大超过合成代谢，导致菌体死亡。,生长曲线的应用,缩短延滞期，以缩短发酵周期 取对数生长期的种子接种 延长对数生长期，有利于形成大量的微生物细胞 采用连续培养 延长稳定期，有利于代谢产物积累 根据细胞内含物判断菌龄； 根据生长期控制培养条件。,三、连续培养,连续培养：当微生物以单批培养的方式培养到对数期的后期时，一方面以一定速度连续流进新鲜培养基，并立即搅拌均匀；另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。这样，培养物就达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上。,单批培养与连续培养的关系,连续培养器的类型,内控制（控制菌体浓度）：恒浊器 外控制（控制培养液流速，以控制生长速率）：恒化器 单级连续培养器 多级连续培养器 一般连续培养器 固定化细胞连续培养器 实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐,按控制方式分,按培养器的级数分,按细胞状态分,按用途分,恒浊器与恒化器,恒浊器（turbidostat）：根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。 恒化器（chemostat）：一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。,恒化器,恒浊器与恒化器的比较 装置 控制对象 培养基 培养基流速 生长速率 产物 应用范围 恒浊器 菌体密度 无限制 不恒定 最高速率 大量菌体 生产为主 （内控制） 生长因子 或与菌体 相平行的 代谢产物 恒化器 培养基 有限制 恒定 低于 不同生长 实验室 流速 生长因子 最高速率 速率菌体 为主 （外控制）,连续培养的优缺点,优点 高效 自控 产品质量较稳定 节约了大量动力、人力、水和蒸汽 缺点 菌种易于退化 易遭杂菌污染 营养物的利用率低,四、影响微生物生长的主要因素,温度 氧气 pH 渗透压 水活度,1、温度,基本原理 温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞膜的流动性及完整性来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。 过高的环境温度会导致蛋白质或核酸的变性失活 过低的环境温度会抑制酶活力，降低细胞的新陈代谢活动。 应用：高温灭菌，低温保藏菌种。,Heat denaturation of proteins,最低生长温度：一般为-5-10，极端为-30 嗜冷菌：20 生长温度最适生长温度 嗜温菌：2045 嗜热菌：45 最高生长温度：一般为8095 最适生长温度：分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。 最适生长温度发酵速度最高时的培养温度代谢产物量最高时的温度生长量最高时温度,微生物各生理过程的不同最适温度 菌 名 生长温度 发酵温度 累积产物温度 嗜热链球菌 37 47 37 乳酸链球菌 34 40 产细胞：2530 产乳酸：30 灰色链霉菌 37 28 北京棒杆菌 32 3335 丙酮丁醇梭菌 37 33 产黄青霉 30 25 20,Cardinal temperatures,Temperature classes,2、氧气,根据微生物与氧的关系，可分为： 专性好氧菌：必需在有氧条件下生长 好氧菌 兼性厌氧菌：在有氧及无氧条件下均能生长，但在有氧条件下生 长得更好。 微好氧菌：生长需要少量的氧，过量的氧常导致这类微生物死 亡。 耐氧菌：生长不需要氧，但氧对其也无毒害。 厌氧菌 （专性）厌氧菌：只能生长在无氧条件下，氧剧毒 ，即使短期 接触空气，也会抑制其生长甚至致死。,(a)专性好氧菌；(b)厌氧菌；(c)兼性厌氧菌；(d)微好氧菌；(e)耐氧菌,厌氧菌的氧毒害机制,O2 + e O2 . 2 O2 . + 2H+ H2O2 + O2 NADH2 NAD,SOD,好氧生物及耐氧菌,2H2O,过氧化氢酶,好氧生物,过氧化物酶,耐氧菌,H2O + O2,3、 pH值,基本原理 使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化，从而影响其生物活性； 引起细胞膜电荷变化，导致微生物细胞吸收营养物质能力改变； 改变环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性。,pH：-lgH+，指外界环境的pH值。 嗜碱微生物 最适生长pH值偏于碱性 （如多数放线菌） 耐碱微生物 微生物 （如链霉菌） 嗜酸微生物 最适生长pH值偏于酸性 （多数真菌） 耐酸微生物 （乳酸杆菌）,不同微生物的生长pH范围 微生物 pH值 最低 最适 最高 氧化硫硫杆菌 0.5 2.03.5 6.0 嗜酸乳杆菌 4.04.6 5.86.6 6.8 大豆根瘤菌 4.2 6.87.0 11.0 褐球固氮菌 4.5 7.47.6 9.0 一种亚硝化单胞菌 7.0 7.88.6 9.4 醋化醋杆菌 4.04.5 5.46.3 7.08.0 金黄色葡萄球菌 4.2 7.07.5 9.3 泥生绿菌 6.0 6.8 7.0 水生栖热菌 6.0 7.57.8 9.5 黑曲霉 1.5 5.06.0 9.0 一般放线菌 5.0 7.08.0 10.0 一般酵母菌 3.0 5.06.0 8.0,几种抗生素产生菌的生长与发酵的最适pH,抗生素产生菌 生长最适pH 合成抗生素最适pH 灰色链霉菌 6.36.9 6.77.3 红霉素链霉菌 6.67.0 6.87.3 产黄青霉 6.57.2 6.26.8 金霉素链霉菌 6.16.6 5.96.3 龟裂链霉菌 6.06.6 5.86.1 灰黄青霉 6.47.0 6.26.5,pH,微生物在生命活动过程中，会改变外界环境中的pH值。 糖类 发酵、氧化 有机酸 有机物 脂肪 水解 有机酸 培养基内 蛋白质 脱羧 胺类 中性成分 (NH4)2SO4 NH4+选择吸收 H2SO4 无机盐 NaNO3 NO3-选择吸收 NaOH,pH调节方法,过酸时：加NaOH、Na2CO3等碱中和 过碱时：加H2SO4、HCl等酸中和 加适当氮源：如尿素、NaNO3、 过酸时 NH4OH或蛋白质等 “ 治本” 提高通气量 过碱时 加适当碳源：糖、乳酸、甘油等 降低通气量 加磷酸缓冲液（K2HPO4 KH2PO4） 加CaCO3或NaHCO3,外 源 调 节,“治标”,内源调节,4、渗透压,渗透压：由于溶质浓度差而在细胞膜两侧造成的压力差。渗透压的大小与溶液中分子或离子的质点数有关。等重的物质，其分子或离子越小，则质点数越多，渗透压越大。 低渗溶液：外界浓度细胞内浓度，细胞失水，发生质壁分离。 绝大多数微生物在0.5%3%的盐浓度范围内可正常生长，10%15%的盐浓度能抑制大部分微生物的生长。,5、水活度aw,水活度aw：表示在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。 自由水：微生物可利用。 细胞内水分状态 结合水：微生物不能利用。 aw定量：在相同温度和压力下，某溶液的蒸汽压P与纯水蒸汽压P0之比，也等于溶液的百分相对湿度。 aw = P/ P0 = ERH/100 纯水： aw = 1，无水： aw = 0， 0 aw1 各种微生物生长繁殖的aw值范围：0.9980.6,微生物生长的最低aw,细菌 一般：0.900.98 嗜盐菌：0.75 酵母菌 一般；0.870.91 高渗酵母：0.610.65 霉菌 一般：0.800.87 耐旱菌：0.650.75,若干事物的aw,新鲜水果：0.970.99 鲜肉（家畜）：0.97 面包：0.86 蔗糖饱和液：0.76 大米、面粉（含水量14%）：0.65 奶粉：0.2,6、化学因素对微生物的影响,常用的化学消毒剂主要有重金属及其盐类、有机溶剂（酚、醇、醛等）、卤族元素及其化合物、染料和表面活性剂等。 重金属离子：可与菌体蛋白质结合而使之变性或与某些酶蛋白的巯基相结合而使酶失活；重金属盐是蛋白质沉淀剂，还可与代谢产物发生鳌合作用而使之变为无效化合物。 有机溶剂：可使蛋白质及核酸变性，也可破坏细胞膜透性使内含物外溢。 碘：可与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活。 氯气：与水反应产生的强氧化剂具有杀菌作用。 染料：在低浓度条件下可抑制细菌生长，革兰氏阳性菌普遍比革兰氏阴性菌对染料更加敏感。 表面活性剂：能降低溶液表面张力，改变微生物细胞膜透性，使蛋白质变性。,五、微生物培养技术的发展,从少量培养发展到大规模培养 从浅层培养发展到厚层（固体）或深层（液体）培养 从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主 从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养 从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养 从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团 从单纯利用微生物细胞到大量培养、利用高等动植物细胞 从单菌发酵发展到混菌发酵 从利用野生菌种发展到利用变异株以及“工程菌”等等,1、微生物的实验室培养,固体培养 好氧菌的培养：主要有试管斜面、培养皿平板及较大型的茄子瓶等的平板培养方法。 厌氧菌的培养 高层琼脂柱：用加有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，以培养相应的厌氧菌。在这种培养基中，越是深层，其氧化还原势越低，因而越有利于厌氧菌的生长。 厌氧培养箱,液体培养 好氧菌的培养 试管液体培养 三角瓶浅层培养 摇瓶培养：广泛用于菌种的筛选以及生理生化和发酵实验。 台式发酵罐：体积一般为几升至几十升 厌氧菌的培养 采用加有有机还原剂（如巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C等）或无机还原剂（铁丝等）的 深层液体培养基，并在其上封以凡士林-石蜡层。 厌氧培养箱,2、生产实践中的微生物培养,固体培养 好氧菌的曲法培养：将接过种的固体基质薄薄地摊铺在容器表面，这样，既可使微生物获得充分的氧气，又可让微生物在生长过程中产生的热量及时释放。 提供营养源 固体基质 有利疏松空气 赋予曲的外形 曲的构成与功能 菌体（菌丝、孢子或细胞）：用作“种子” 外酶类：可用作粗酶制剂 代谢产物 其他：如柠檬酸、赤霉素和抗生素等,液体培养 好氧菌的培养 利用发酵罐作深层液体培养 发酵罐：培养基配制系统、蒸汽灭菌系统、空气压缩和过滤系统、搅拌系统、发酵产物的后处理系统等。 厌氧菌大规模的液体培养装置 厌氧发酵罐不必安装通气搅拌装置，其体积一般可明显大于有通气、搅拌设备的发酵罐（国际上厌氧发酵罐的体积可达到2000m3），从而提高生产效率，有利于推行连续发酵作业。,Thank you!,