《生物化学》教学课件：第16章 DNA的生物合成（part2bc）

目目 录录 DNA的合成及重组的合成及重组 DNA Biosynthesis and Recombination第十六章第十六章目目 录录uFEN1（flap endonuclease 1）具有核酸内切酶）具有核酸内切酶和和53 核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。uFEN1参与去除冈崎片段参与去除冈崎片段5 端的端的RNA引物。引物。6.FEN1和和RNAse H切除切除RNA引物引物目目 录录RNAse H是是核酸内切酶核酸内切酶，参与冈崎片段成，参与冈崎片段成熟时熟时切除切除5 端端RNA引物引物，底物，底物RNA连接在连接在DNA链的链的5 端，切割后在端，切割后在DNA链的链的5 端残留一个核糖端残留一个核糖核苷酸，这个核苷酸再被核苷酸，这个核苷酸再被FEN1切除。切除。目目 录录DNA复制需要复制需要DNA解旋酶打开解旋酶打开DNA双螺双螺旋，使复制模板链得以暴露。旋，使复制模板链得以暴露。7.DNA解旋酶打开双螺旋以解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板暴露复制模板目目 录录8.真核复制叉有真核复制叉有1个个Pol 和和2个个Pol 复合物复合物真核真核DNA复制叉模型复制叉模型目目 录录Pol /引发酶引发酶合成合成RNA-DNA引物引物Pol 合成前导链和后随链合成前导链和后随链RFC 识别引物识别引物iDNA的的3 端并驱除端并驱除Pol /引发酶引发酶PCNA 结合结合DNA并引入并引入Pol RNAse H I/FEN1 切除冈崎片段切除冈崎片段5 端的端的RNA引物引物真核生物复制过程中酶及功真核生物复制过程中酶及功能能目目 录录Pol （或（或Pol ）填补冈崎片段之间的空隙填补冈崎片段之间的空隙DNA连接酶连接酶 封口封口RPA 稳定解旋后的单链稳定解旋后的单链DNA解旋酶解旋酶 复制叉的形成和移动必不可少复制叉的形成和移动必不可少拓扑异构酶拓扑异构酶 释放复制叉前进时产生的扭曲应力释放复制叉前进时产生的扭曲应力目目 录录(三三)引发和延伸发生引发和延伸发生DNA聚合聚合酶酶/转换转换 识别染色体识别染色体DNA复制起点和复制起点和DNA局部解旋后，局部解旋后，Pol /引发酶复合物结合于复制起点，这一步引发酶复合物结合于复制起点，这一步叫做叫做引发体组装引发体组装。引发体组装引发体组装包括包括DNA解旋酶解旋酶与与Pol /引发酶引发酶相相互作用。互作用。1.解旋酶与解旋酶与Pol /引发酶相互作用组装引发体引发酶相互作用组装引发体目目 录录 前导链：出现在引发后期前导链：出现在引发后期 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际后随链：发生于每个冈崎片段合成之际 发生发生DNA聚合酶聚合酶/转换的原因是转换的原因是Pol 不具备不具备持续合成能力持续合成能力 DNA聚合酶聚合酶/转换的转换的关键蛋白是关键蛋白是RFC2.DNA聚合酶聚合酶/转换转换目目 录录真核真核DNA聚聚合酶转换和合酶转换和后随链合成后随链合成目目 录录首先首先RNAse H利用核酸内切酶活性切割连接在冈利用核酸内切酶活性切割连接在冈崎片段崎片段5 端的端的RNA片段，在片段，在RNA-DNA引物连接点旁留下引物连接点旁留下1个核糖核苷酸；个核糖核苷酸；然后然后FEN1利用利用53 核酸外切酶活性核酸外切酶活性切除这最后一切除这最后一个核糖核苷酸。个核糖核苷酸。(四四)切除切除RNA引物有两种机制引物有两种机制解旋酶解旋酶Dna2具有依赖具有依赖DNA的的ATPase和和35 解旋酶解旋酶活性，其解旋作用可以使前一个冈崎片段的活性，其解旋作用可以使前一个冈崎片段的5 端引物形成端引物形成“盖子盖子”结构，再由结构，再由FEN1的内切酶活性的内切酶活性切除引物。切除引物。依赖依赖RNAse H/FEN1切除方式：切除方式：依赖依赖Dna2/FEN1切除方式：切除方式：目目 录录切除切除RNA引物的两种机制引物的两种机制RNAse H/FEN1Dna2/FEN1目目 录录真核所有染色体真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞复制仅仅出现在细胞周期的周期的S期期，而且只能复制一次。，而且只能复制一次。(五五)真核染色体在每个细胞真核染色体在每个细胞周期中只能复制一次周期中只能复制一次目目 录录1.前复制复合物在前复制复合物在G1期形成而在期形成而在S期被激活期被激活真核细胞真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制的起始分两步进行，即复复制基因的选择制基因的选择和和复制起点的激活。复制起点的激活。复制基因（复制基因（replicator）是指是指DNA复制起始复制起始所所必需的必需的全部全部DNA序列序列。目目 录录 复制基因的选择复制基因的选择出现于出现于G1期期，基因组的每个复，基因组的每个复制基因位点均组装制基因位点均组装前复制复合物（前复制复合物（pre-replicative complex，pre-RC）。复制起点的激活复制起点的激活出现于细胞进入出现于细胞进入S期期以后，这一以后，这一阶段将阶段将激活激活pre-RC，募集若干复制基因结合蛋，募集若干复制基因结合蛋白和白和DNA聚合酶，并起始聚合酶，并起始DNA解旋。解旋。在原核细胞中，复制基因的识别与在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解解旋、募集旋、募集DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞聚合酶偶联进行。而在真核细胞中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。每个细胞周期中仅复制一次。目目 录录ORC至少募集两种解旋酶加载至少募集两种解旋酶加载蛋白蛋白Cdc6和和Cdt1。复制起点识别复合物（复制起点识别复合物（originrecognition complex，ORC）识别并结合复制基因。识别并结合复制基因。三种蛋白质一起募集真核细胞三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶解旋酶Mcm2-7。前复制复合物（前复制复合物（pre-RC）的形成）的形成目目 录录pre-RC磷酸化导致在复制起点组装其他复制因子磷酸化导致在复制起点组装其他复制因子并起始复制，复制因子包括并起始复制，复制因子包括3种种DNA聚合酶。聚合酶。DNA聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先Pol 和和Pol 结合，然后是结合，然后是Pol /引发酶。引发酶。在在S期期，pre-RC被蛋白激酶（被蛋白激酶（Ddk和和Cdk）磷）磷酸化，从而被激活。酸化，从而被激活。目目 录录pre-RC的激活的激活和组装真核和组装真核DNA复制叉复制叉目目 录录（1）激活）激活pre-RC，以起始，以起始DNA复制；复制；（2）抑制形成新的）抑制形成新的pre-RC。2.Cdk控制控制pre-RC的形成和激活的形成和激活真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶（酶（cyclin-dependent kinases，CDK）严格控制）严格控制pre-RC的形成和激活。的形成和激活。Cdk功能：功能：目目 录录在每个细胞周期过程中，仅有一次机会形成在每个细胞周期过程中，仅有一次机会形成pre-RC，也仅有一次机会激活，也仅有一次机会激活pre-RC。pre-RC在被激活后即解体，所暴露的复制基在被激活后即解体，所暴露的复制基因可形成新的因可形成新的pre-RC并迅速结合并迅速结合ORC。但在。但在S、G2和和M期，高活性的期，高活性的Cdk抑制抑制pre-RC的其他组分的其他组分结合结合ORC。只有当染色体分离和细胞分裂完成时，。只有当染色体分离和细胞分裂完成时，Cdk的活性消失，新的的活性消失，新的pre-RC才能形成。才能形成。目目 录录(六六)端粒酶确保染色体末端复制完整端粒酶确保染色体末端复制完整 前导链前导链产生产生完整完整的子染色单体。的子染色单体。后随链后随链3 3 端留下端留下缩短的缩短的未复制的未复制的ssDNA区区。目目 录录端粒（端粒（telomeres）由富含由富含TG的重复序列组成。的重复序列组成。人的端粒重复序列为人的端粒重复序列为5-TTAGGG-3。这些重复序列多为双链，但每个染色体的这些重复序列多为双链，但每个染色体的3端比端比5 端长，形成单链端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题。染色体末端复制问题。目目 录录端粒酶（端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（是一种核糖核蛋白（RNP），），由由RNA和蛋白质组成。和蛋白质组成。端粒酶以自己的端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的组分作为模板，以染色体的3 端端ssDNA（后随链模板）（后随链模板）为引物，将端粒序列添加为引物，将端粒序列添加于染色体的于染色体的3 端。这些新合成的端。这些新合成的DNA为单链为单链。目目 录录目目 录录目目 录录 DNA聚合酶聚合酶 ：催化合成催化合成DNA DNA解旋酶（解旋酶（helicase）：）：解开解开DNA双螺旋，暴露双螺旋，暴露复制模板链复制模板链 引发酶引发酶：引发，即合成引发，即合成RNA引物，利用引物引物，利用引物3-OH开始延伸开始延伸 DNA连接酶：连接酶：连结冈崎片段连结冈崎片段 其他酶和蛋白因子其他酶和蛋白因子小结：小结：DNA复制需要多种酶参与复制需要多种酶参与如：起稳定作用的单链如：起稳定作用的单链DNA结合蛋白结合蛋白（SSB）和改变）和改变DNA超螺旋状态的超螺旋状态的DNA拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerase）等）等目目 录录DNA聚合酶的聚合酶的合成前误差控制合成前误差控制(presynthetic error control)和和校正控制校正控制(proofreading control)功能。功能。细胞修复系统细胞修复系统是是DNA复制高度忠实性的重要因素。复制高度忠实性的重要因素。复制起始利用引物复制起始利用引物也是确保也是确保DNA复制忠实性的重要复制忠实性的重要机制之一。机制之一。DNA复制具有高度忠实性复制具有高度忠实性目目 录录 DNA复制是双向复制复制是双向复制 一个起点，两个复制叉，双向复制。一个起点，两个复制叉，双向复制。两个起点，两个生长点，单向复制。两个起点，两个生长点，单向复制。一个起点，一个复制叉，单向复制。一个起点，一个复制叉，单向复制。DNA链的合成链的合成3种方式：种方式：目目 录录线粒体线粒体DNA的的D环（环（D-loop）复制）复制噬菌体的滚环（噬菌体的滚环（rolling circle）复制）复制 三、线粒体和噬菌体三、线粒体和噬菌体DNA复制具有特殊方式复制具有特殊方式目目 录录（一）（一）线粒体线粒体DNA按按D环方式复制环方式复制环形、双螺旋环形、双螺旋DNA分子分子两条链一条为重链（两条链一条为重链（H链），另一条为轻链（链），另一条为轻链（L链）链）dNTPDNA-pol 线粒体线粒体DNA分子特点：分子特点：目目 录录l有特异的复制起点；有特异的复制起点；l环形线粒体环形线粒体DNA两条链（两条链（H和和L）的复制不同步）的复制不同步D环或取代环（环或取代环（displacement loop）：线粒体）：线粒体DNA复制开始以复制开始以H链作为模板合成新的链作为模板合成新的L链，取链，取代原来的代原来的L链并和链并和H链互补，而原来的链互补，而原来的L链则保持链则保持单链状态，形成类似英文字母单链状态，形成类似英文字母D的区域；的区域；l两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；l线粒体线粒体DNA复制也需要复制也需要RNA引物引物。线粒体线粒体DNA复制特点：复制特点：目目 录录（二）噬菌体（二）噬菌体DNA按滚环方式复制按滚环方式复制环形双螺旋环形双螺旋DNA分子分子一条为模板链，另一条为非模板一条为模板链，另一条为非模板链链E.coli 噬菌体噬菌体DNA的分子结构特点：的分子结构特点：仅以一条链作为模板合成若干环形仅以一条链作为模板合成若干环形DNA分子拷贝分子拷贝噬菌体噬菌体DNA复制的方式是滚环复制复制的方式是滚环复制噬菌体噬菌体DNA复制特点：复制特点：目目 录录噬菌体噬菌体DNA复制首先由它自己编码的复制首先由它自己编码的A蛋蛋白在白在非模板链非模板链上造成缺口，再以所产生的游离上造成缺口，再以所产生的游离3 端羟基作为引物，并在宿主细胞的端羟基作为引物，并在宿主细胞的DNA聚合聚合酶、解旋酶和酶、解旋酶和SSB蛋白等作用下合成新链，新蛋白等作用下合成新链，新链和模板链互补并取代了原来的非模板链。这链和模板链互补并取代了原来的非模板链。这种复制方式称为滚环复制种复制方式称为滚环复制。滚环复制：滚环复制：目目 录录3-OH5-P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 目目 录录双螺旋双螺旋DNA在复制起点解链不一定导致两条在复制起点解链不一定导致两条链同时复制，也可能利用一条链作为模板起链同时复制，也可能利用一条链作为模板起始始DNA合成。合成。双螺旋双螺旋DNA的两条的两条DNA链的复制起点也可能链的复制起点也可能处于不同的位置。处于不同的位置。滚环复制和滚环复制和D环不对称复制的存在说明：环不对称复制的存在说明：目目 录录DNADNA的反转录合成的反转录合成Reverse transcription第三节第三节目目 录录RNA肿瘤病毒肿瘤病毒 DNA原病毒（或前病毒）原病毒（或前病毒）RNA肿瘤病毒肿瘤病毒Temin等提出，原病毒（等提出，原病毒（provirus）DNA是是RNA肿瘤病毒在复制过程中的中间物。肿瘤病毒在复制过程中的中间物。*反转录的发现发展了中心法则反转录的发现发展了中心法则目目 录录DNA中间模板分子（中间模板分子（mRNA）蛋白质蛋白质中心法则：中心法则：反转录酶的发现发展了中心法则反转录酶的发现发展了中心法则目目 录录反转录病毒反转录病毒（retroviruses）：RNA病毒，病毒，含有含有反转录酶反转录酶反转录：反转录：在反转录酶的作用下以在反转录酶的作用下以RNA为模板合成为模板合成DNA的过程。的过程。目目 录录RNA指导的指导的DNA聚合酶活性；聚合酶活性；DNA指导的指导的DNA聚合酶活性；聚合酶活性；RNAse H的活性是指它能够从的活性是指它能够从53 和和35 两个方向水解两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的杂合分子中的RNA。一、一、反转录酶以反转录酶以tRNA为引物合成双链为引物合成双链cDNA反转录酶有反转录酶有3种酶的活性：种酶的活性：目目 录录反转录酶的结构反转录酶的结构目目 录录反转录病毒反转录病毒RNA基因组和原病毒基因组和原病毒目目 录录反转录病毒反转录病毒RNA基因组基因组转变为双链转变为双链cDNA的途径的途径目目 录录二、反转录病毒在宿主细胞内的主要活动二、反转录病毒在宿主细胞内的主要活动（一）（一）反转录合成双链反转录合成双链cDNA（二）（二）双链双链cDNA插入宿主染色体形成原病毒插入宿主染色体形成原病毒原病毒或前病毒：原病毒或前病毒：存在于真核染色体中和反转存在于真核染色体中和反转录病毒录病毒RNA基因组相对应的基因组相对应的双链双链DNA序列。序列。目目 录录gag基因基因编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）;pol基因基因编码编码3种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶;env基因基因编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白。编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白。（三）原病毒（三）原病毒DNA转录产生病毒转录产生病毒RNA具有自我复制能力的反转录病毒基因组具有自我复制能力的反转录病毒基因组含有含有3个基因：个基因：目目 录录直接翻译产生多蛋白直接翻译产生多蛋白Gag和和Gag-Pol。含有包装信号，因此构成完整的病毒基因组。含有包装信号，因此构成完整的病毒基因组。大约一半初级转录产物经过剪接加工形成大约一半初级转录产物经过剪接加工形成gag-pol mRNA和和env mRNA。原病毒初级转录产物有原病毒初级转录产物有3种重要功能：种重要功能：目目 录录初级转录产物多蛋白初级转录产物多蛋白Gag-Pol，经过蛋白酶水，经过蛋白酶水解，可产生反转录酶、蛋白酶和整合酶。解，可产生反转录酶、蛋白酶和整合酶。多蛋白多蛋白Gag经过加工，生成经过加工，生成4种病毒衣壳蛋白。种病毒衣壳蛋白。env基因编码的基因编码的Env蛋白，经过加工以后插入病蛋白，经过加工以后插入病毒外膜磷脂双层。毒外膜磷脂双层。这些病毒蛋白和病毒这些病毒蛋白和病毒RNA基因组可以迅速组装基因组可以迅速组装成许多新的反转录病毒颗粒。成许多新的反转录病毒颗粒。（四）病毒（四）病毒RNA经翻译和包装形成反转录经翻译和包装形成反转录病毒颗粒病毒颗粒