电泳技术和常用电泳仪.ppt

第六章 电泳技术和常用电泳仪,第六章 电泳技术和常用电泳仪,一、概述 generalization) 电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（electrophoresis technique）。可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（electrophoresister）。,第六章 电泳技术和常用电泳仪,目前，电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成份的分离和鉴定，甚至还用于细胞与病毒的研究。 临床常用的电泳分析方法主要有醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和毛细管电泳等。,第一节 电泳原理 第二节 常用电泳技术和电泳方法 第三节 常用电泳设备的基本结构及技术指标 第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式 第五节 电泳仪的临床应用 第六节 电泳技术的质量控制,本章目录,第一节 电泳原理,一、电泳的基本原理 物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相 等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场 中它们的移动方向和移 动速度也不同，因此可 使它们分离。,06-01电泳现象和电渗流现象。,第一节 电泳原理,若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： F引=E Q （6-1） 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6rV （6-2） 当F引=F阻时 EQ= 6rV V = EQ/6r （6-3） 由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度()成反比。,第一节 电泳原理,二、影响电泳的外界因素 （一）电场强度 （二）溶液的pH值 （三）溶液的离子强度 （四）电渗作用 （五）粒子的迁移率 （六）吸附作用,影响电泳的环境因素 在电场中被分离物质的泳动速度除受本身性质如所带电荷的性质和数量、分子本身的大小和形状、分子的水化程度、解离趋势、两性行为等影响外，还与其它外界环境因素有关。 1 电场强度的影响：电场强度是指电场中每厘米的电位降，也称电位梯度或电势梯度。电场强度对电泳的速度起着重要作用，电场强度高，带电颗粒泳动速度快，电场强度低，带电颗粒泳动速度慢。,2 溶液pH值的影响：大部分生物大分子都具有阳离子和阴离子基团，这些基团的解离常数不同，溶液的pH值决定被分离物质带电基团的解离程度，所以生物大分子的净电荷取决于环境的pH值。pH影响着生物大分子的电泳迁移率，溶液的pH值距离蛋白质的等电点pI越远，蛋白质带电性越强，泳动速度越快；pH值距离蛋白质的pI越近，蛋白质带电性越弱，泳动速度越慢。电泳时为保持pH恒定，必须采用缓冲液作为电极缓冲液。在分离蛋白质时，要选择合适pH的缓冲液，使待分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大差异，有利于彼此分开。,3 溶液离子强度的影响：溶液中的离子强度直接影响被分离物质的电动电势()。带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比。如果溶液的离子强度越大，电动电势越小，泳动速度越慢；如果溶液的离子强度越小，电动电势越大，泳动速度越快。高离子强度时电泳条带较细窄。一般最适合的离子强度在0.020.2之间。溶液离子强度的计算公式如下： I = 1 /2scz2 式中，I为离子强度，s表示溶液中有s种离子，c为离子的摩尔浓度(mol /L)，z为离子价数。溶液中离子种类多，浓度大，离子价数高，则离子强度大。,4 电渗的影响：固体支持物表面的电荷使支持物附近溶液分子形成偶电层，溶液在电场中向一定方向移动，即电渗现象，溶液移动的同时携带颗粒一起移动。,5 温度的影响：在凝胶电泳过程中要产生焦尔热，而热对电泳的分离效果影响很大。温度升高时，介质粘度下降，分子运动加剧，使自由扩散的速度变快，迁移率增加。 6 介质的影响：介质的交联度直接影响分离效果，介质的纯度影响聚胶效果，介质的非特异性吸附会增大电渗。,第二节 常用电泳技术和电泳方法,一、电泳技术的分类 （一）根据工作原理的不同：可分为移界电泳、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫电泳等。,按分离原理分类 (1)区带电泳(zone electrophoresis，ZEP)：是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后在介质上加电场，带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移，在电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带(图3-2a)，这是当前应用最广泛的电泳技术。,(2)移界电泳(moving boundary electrophoresis，MBEP)：是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上，带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定(图3-2b)。 (3)稳态电泳(steady state electrophoresis)：带电颗粒在电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，电泳条带的宽度不随时间的变化而变化，如等速电泳(isotachophoresis，ITP)、等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)(图2c、2d)。,a b c d,图3-2 各种电泳分离原理示意图 a 区带电泳 b 移界电泳 c 等速电泳 d 等电聚焦,第二节 常用电泳技术和电泳方法,（二）根据有无固体支持物可分为：自由电泳和支持物电泳 （三）根据支持载体的位置或形状可分成：水平电泳、垂直电泳、板状电泳、柱状电泳、U型管电泳、倒V字形电泳、毛细管电泳等。 （四）根据支持物的特点又可分为： 无阻滞支持物电泳。高密度的凝胶电泳。 （五）根据电源控制的不同，一般可分为以下3类： 1. 恒压电泳; 2. 恒流电泳; 3. 恒功率电泳 。,第二节 常用电泳技术和电泳方法,（六）根据自动化程度的不同，可分为半自动和 全自动型。 （七）根据其功能的不同，可分为制备型、分析 型、转移型、浓缩型等。 （八）根据用法的类型可分为：双向电泳、交叉 电泳、连续纸电泳、电泳层析相结合技术等。 （九）根据不同的使用目的可分为：核酸电泳、 血清蛋白电泳、制备电泳、DNA测序电泳等。,第二节 常用电泳技术和电泳方法,二、电泳方法简介 （一）纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。,06-02 平卧式电泳槽装置示意图,将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（100V1000V）进行电泳。,第二节 常用电泳技术和电泳方法,（二）醋酸纤维素薄膜电泳 电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、 电泳时间短、样品 用量少。因此特别 适合于病理情况下 微量异常蛋白的检测。,06-03 血清蛋白的电泳图谱,第二节 常用电泳技术和电泳方法,（三）凝胶电泳 由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。 它具有机械强度好、弹性大、 透明、化学稳定性高、无电渗 作用、设备简单、样品量小 (1100g）、分辨率高等优点。,06-04 凝胶电泳图,Bis将单体长链间连成网状结构：,第二节 常用电泳技术和电泳方法,（四）等电聚焦电泳 1 等电聚焦电泳过程 一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH值梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH值位置上，最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。,06-05 净电荷与PH的关系曲线,第二节 常用电泳技术和电泳方法,2等电聚焦电泳的特点 使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度；由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；电泳速度快;分辨率高;加入样品的位置可任意选择；可用于测定蛋白质类物质的等电点;适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。,第二节 常用电泳技术和电泳方法,（五）等速电泳 采用两种不同浓度的电解质组成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解 质之间的空隙中移动， 实现分离。,06-06 等速电泳示意图,第二节 常用电泳技术和电泳方法,（六）双向凝胶电泳（二维电泳） 第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。 第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状 。,第二节 常用电泳技术和电泳方法,胶性 PH9 中电 加解 入质 了溶 双液 PH3,加上电场后建立稳定PH梯度,蛋白质溶液加入，建立电场,染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开,第一向 等电聚焦,PI逐渐降低,等电聚焦胶放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上,第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量逐渐降低,PI 逐渐降低,06-07 双向凝胶电泳示意图,第二节 常用电泳技术和电泳方法,(七）免疫电泳 免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。,第三节 常用电泳设备的基本结构及技术指标,一、常用电泳设备的基本结构 （一）电泳电源 （二）电泳槽 （三）附加装置,06-08 平卧式电泳槽装置示意图,从第一台商品自由移界电泳系统的问世以后，近50年来电泳仪器的发展迅猛，尤其是随着凝胶电泳技术的成熟及广泛应用，各种类型的凝胶电泳装置层出不穷，使电泳技术得以迅速发展。凝胶电泳仪作为实验室的常规小型仪器，种类很多。随着科学技术的不断发展，电泳仪器的分析对象也越来越专门化，分辨率越来越高，操作越来越简单，性能越来越稳定。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。,电泳仪： 根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类： (1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳； (2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序； (3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。,电泳槽： 根据电泳种类不同，对电泳槽的设计也不一样。电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。 (1)自由界面电泳槽 Tiselius设计的自由界面电泳槽（图3-3）是一个U形玻璃管，在U形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学系统“纹影法(schlieren)”照相，得到电泳图谱。这种电泳槽目前已不使用。90年代初发展起来的高效毛细管电泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。,3 Tiselius自由界面电泳装置示意图,(2)管状电泳槽 50年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖，上电泳槽具有若干个孔，可插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内，凝胶在电泳管中聚合成柱状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色后呈圆盘状，因而称圆盘电泳(disc electrophoresis)。,圆盘电泳槽,(3)板状电泳槽 板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳(slab electrophoresis)。板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠；还可进行双向电泳。另外，板胶电泳时产生的热量容易消散，凝胶电泳结果便于照相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。,垂板电泳槽,转移电泳槽,平板电泳槽,双向电泳槽,4.3附属设备 随着电泳技术的发展，电泳技术的种类逐渐增加，凝胶电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如梯度混合仪、外循环恒温系统、脱色仪、凝胶干燥系统、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。,第三节 常用电泳设备的基本结构及技术指标,二、电泳仪的主要技术指标 1 输出电压 8 连续工作时间 2 输出电流 9 保护措施 3 输出功率 10 显示方式 4 电压稳定度 11 定时方式 5 电流稳定度 12 电源电压 6 功率稳定度 13 电源频率 7 输出组数 14 功耗,琼脂糖凝胶电泳步骤：,1.缓冲液的制备： 常用TAE或TBE，PH值在69之间。 无论哪种都含EDTA，可去除二价金属离子。,2.琼脂糖胶板的制备 1）取一定量的琼脂糖放入三角瓶中，加入电泳缓冲液配制成一定浓度的琼脂糖溶液（如基因组DNA：0.8%；PCR产物1.2%）。 2）选择凝胶盘放入制胶架中，选好梳子插在制胶架上。 3）加热煮沸使溶液澄清，冷却至60加入10mg/mlEB，摇匀后到入制胶架中。 4）室温放置3040分钟待凝胶聚合后，轻轻拔掉梳子（注意：先拔一侧，否则垂直拔除产生真空导致部分凝胶带出）。,3.在两边槽中加入电泳缓冲液，使凝胶全部被浸没，液面应高出胶面1mm。 4.在梳井内加样，注意避免引入气泡。 5.盖好上盖，接通电泳仪。 6.根据实际情况选择适宜的电压即可电泳。长胶需较高电压，但是采用高电压所需电泳时间较短，发热高，分辨率低，适合筛选阳品或检查样品纯度。反之，低电压，发热少，分辨率高，但费时。 7 .电泳实验结束后，先关闭电泳仪；随之拔除电源线，然后打开电泳槽上盖，取出凝胶托盘。,毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。,20世纪3040年代 蒂塞利乌斯 (A.W.K.Tiselius）建立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术 获得1948年诺贝尔化学奖,1981年 J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。 上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分析方法。,1 毛细管电泳的原理 2 分离模式 3 进样与检测 4 毛细管电泳的应用,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,06-09 毛细管电泳仪装置示意图,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,三、毛细管电泳的特点 1. 高灵敏度 2. 高速度 3. 高分辨率 4. 样品少 5. 自动化程度高 6. 应用范围广,06-10 英特雷勃 全自动电泳仪,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,一、毛细管电泳的相关概念 1. 电场强度 （Electric Field Strength） 2. 电泳淌度 ( Electrophoretic Mobility) 3. 迁移时间 （Migration Time） 4. 电泳速度 ( Electrophoretic Velocity) 5. 电渗流 （Electroosmotic Flow，EOF） 6. 焦耳热 （Joule Heating）,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,二、毛细管电泳的基本工作原理 溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异 而实现分离。,第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理2 电泳和电渗,电泳 是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。 电渗 是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。,第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理2 电泳和电渗,电泳 行为与特性使用淌度描述 即单位场强(E)下离子的平均电泳速度 ep=/E 实验中，只发生电泳时有效淌度 ef =ef (L /V) =( l / tm )(L /V) 毛细管有效长度 迁移时间 毛细管总长度 电压,第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理2 电泳和电渗,电渗 与固液界面的双电层有着密切的关系 在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（electroosmotic flow ,EOF）。,固液两相间的总电势-热力学电势-0,Zeta电势-,第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理2 电泳和电渗,电渗流的流型特点 电渗流 HPLC 塞流 层流,第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理2 电泳和电渗,电渗流的表示 电渗流的大小可用淌度(eo)或电渗流系数表示 eo =eo / E = l /( teoE ) 电渗流速度 毛细管有效长度 电渗流流出时间 电场强度,第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理2 电泳和电渗,电渗流的意义 电泳过程中，伴随着电渗现象 电渗流的速度比电泳速度快57倍 利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析 电渗流是毛细管电泳分离的重要参数 控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。,分情况而论,第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理2 电泳和电渗,改变电渗流的方法 改变外加径向电场 改变缓冲液成分和浓度 Zeta电势 改变缓冲液pH 加入添加剂 改变温度 粘度,盐-离子强度,表面活性剂,eo正比于Zeta电势和介质的介电常数 反比于介质的黏度 Zeta电势正比于双电层厚度和界面有效电荷密度 反比于介质的介电常数,第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素,区带宽度展宽因素 焦耳热 流型 电泳扩散 毛细管壁对组分的吸附,焦耳热 细内径（100m），粗外径的毛细管柱,温度轮廓 - 黏度轮廓 -速度轮廓,第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素,进样 试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。 细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。 一般进样区带控制在柱长的1% 电泳扩散 试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。D值低的物质展宽程度小。,第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素,毛细管壁对组分的吸附 电泳峰拖尾或变形，甚至消失。 抑制吸附作用常用的方法有： 使用极端pH条件 加入中性盐或两性离子化合物 对毛细管内壁进行涂层处理,第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,四、毛细管电泳的分离模式 （一）毛细管区带电泳 它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下，依迁移速度的不同而进行分离的。根据组分的迁移时间 进行定性，根据电泳峰 的峰面积或峰高进行定 量分析。,06-11 毛细血管区带电泳原理图,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（二）毛细管凝胶电泳 将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，能根据待测组分的质荷比和分子体积的不同而进行分离。 适用于分离、测定肽类、蛋白质、DNA类物质的分离。,毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点 : 电泳峰尖锐，柱效极高 短柱上实现极好的分离 试样容量为1012g 主要缺点:制备柱较困难，寿命较短 已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核 酸、DNA等强有力的工具。例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相结合，用于DNA序列快速分析。,第22章 毛细管电泳 222 分离模式3 毛细管凝胶电泳,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（三）毛细管胶束电动色谱(MECC) 使MECC系统中存在两个相：流动的水相和起到固定相作用的胶束相。在含有胶束的流动相中，溶质在“水相”和“胶束相”(准固定相)之间进行分配，即使是中性溶质，因其本身疏水性不同，在二者之间的分 配也会有差异，疏水性强的溶质在“胶束相”中停留时间长，迁移速度就慢。反之，亲水性强的溶质迁移速度就快，最终中性溶质将依其疏水性不同而得以分离。,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,06-12毛细管胶束电动色谱原理图,胶束电动色谱的应用特点: 使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离中性化合物. 比高效液相色谱更为高效. HPLC 分离柱效为500025000理论板数/m MEKC 可达到50000500000理论板数/m 比高效液相色谱更为高速.MEKC分离时间通常小于30min，但达到相仿效率的毛细管LC，需要更长的时间。,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（四）毛细管等电聚焦电泳 不同等电点的分子分别聚集在不同的位置上，不作迁移而彼此分离，这就是等电聚焦分离过程。毛细管的等电聚焦是在毛细管内实现的等电聚焦过程，具有极高的分辨率，通常可以分离等电点差异小于 0.01pH单位的两种蛋白质，例如肽类、蛋白质的分离。,方法: 进样等电聚焦检测 先将脱盐的试样（蛋白质）以1的浓度与两性电解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)，置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端，置于阴极电解质如NaOH中。 施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域内停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管内很窄的不同pH区域内聚焦. 在阳、阴极电解液中加入盐如NaCI或NaOH,破坏pH梯度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生迁移、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。,第22章 毛细管电泳 222 分离模式5 毛细管等电聚焦,特点: 等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这一过程可用于浓缩试样组分。 具有极高的分辩率，可以分离等电点相差0.01pH的两种蛋白质. 注意:电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定,第22章 毛细管电泳 222 分离模式5 毛细管等电聚焦,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（五）毛细管等速电泳 毛细管内首先导入具有比被分离各组分高电泳淌度的前导电解质，然后进样，随后再导入比各分离组份低电泳淌度的尾随电解质，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中发生分离。,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（六）毛细管电色谱 它包含了电泳和色谱两种机制，是在毛细管中填充 或在毛细管壁 上键合（或涂壁）固 定相，从而构成毛细 管色谱柱，依靠电渗 流推动流动相，携带 样品迁移，根据样品 分子的质荷比、分子 尺寸及分配系数的差 别而分离。,06-13 CEC-加压毛细管电色谱仪,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,五、毛细管电泳仪的基本结构 毛细管电泳仪的结构并不复杂，主要有高压源、毛细管柱、检测器，以及两 个供毛细管两端插入而又可 和电源相连的缓冲液槽。 （一）毛细管柱 （二）检测器 （三）毛细管电泳 法的进样技术,06-14毛细管电泳仪,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,六、常用各种电泳仪简介 （一）稳压稳流电泳仪 稳压稳流电泳仪是中压电泳仪。其输出电压的调节范围为0V600V、输出电流为0mA100mA。该机工作稳定性好、调节范围宽，并设有完善的短路保护电路和过流保护电路，是目前国内中、低压电泳实验中应用最广泛的电泳仪之一。,06-15 稳压稳流电泳仪,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（二）全自动醋纤膜电泳仪 全自动醋纤膜电泳仪为全自动电泳仪，有可见光单系统，使用醋酸纤维薄膜电泳片，优点为自动化程度高。只需将样品、试剂、电泳片放好，人员可离机完成实验并得到结果。,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（三）全自动荧光/可见光双系统电泳仪 全自动荧光/可见光双系统电泳仪为全自动电泳仪，具有荧光/可见光双系统，在使用荧光试剂项目如CK、LD同工酶时为全自动。只需将样品、试剂、琼脂糖凝胶电泳胶片放好后，操作人员可离机完成实验并得到结果。,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（四）全自动琼脂糖电泳仪 全自动电泳仪，有可见光单系统，使用琼脂糖凝胶电泳胶片，优点为灵敏度高，可适用于低浓度蛋白检验 。该仪器自动化程度较差，当电泳结束和染色脱色完成后，工作人员必须将电泳片由机器中取出。,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（五）双向电泳及双向电泳-液相色谱-质谱联用 双向电泳是将样品进行电泳后，在它的直角方向再进行一次电泳。双向电泳第一向为等电聚焦，第二向为梯度SDS电泳。样品经过电荷与质量两次分离后可得到分子的等电点、分子量等信息。这是目前所有电泳技术中分辨率最高，信息量最多的技术，已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（六）高效毛细管电泳及高效毛细管电泳-质谱联用 高效毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为推动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。高效毛细管电泳是一种迅速发展的分离技术，仪器简单、操作简便、分析速度快、分离效率高、操作模式多、开发分析方法容易、实验成本低、消耗少、应用范围极广。,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（七）毛细管电泳芯片 利用毛细管电泳芯片可以进行DNA长度分析、序列分析和基因分型等研究。是利用芯片分离荧光标记的寡核苷酸，整个分离过程在45s之内，而芯片的长度仅为3.8cm。因为其可承载高电压（2300V/cm）并具有较小的样品体积，故有利于得到较好的分离效果。,第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式,（八）DNA测序系统 该系统利用凝胶毛细管的原理，将多道毛细管阵列设计，用四种不同的荧光染色标记4种核苷酸，在模板上合成DNA单链，然后在DNA外切酶的作用下进行碱基的连续水解和释放，用激光识别和记录释放的碱基。,06-16 DNA测序系统,第五节 电泳仪的临床应用,一、 血清蛋白电泳 新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后，通常可见5条带，即清蛋白、1、2、和球蛋白。许多疾病总血清蛋白浓度和各蛋白组分的比例有所改变，通过血清蛋白电泳图谱能帮助我们对某些疾病进行诊断及鉴别诊断。,06-17 血清蛋白电泳图谱,第五节 电泳仪的临床应用,二、尿蛋白电泳 临床进行尿蛋白电泳的主要目的是：确定尿蛋白的来源；了解肾脏病变的严重程度（选择性蛋白尿与非选择性蛋白尿），从而有助于诊断和预后的判断。 当不能进行肾活检时 ，尿蛋白电泳结果能 很好地协助临床判断 肾脏的主要损害。,06-18 尿蛋白电泳图谱,第五节 电泳仪的临床应用,三、血红蛋白及糖化血红蛋白电泳 应用电泳法鉴别患者血液中Hb的类型及含量，对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。Hb电泳结果应根据不同年龄人群进行分析。,06-19 血红蛋白电泳图谱,第五节 电泳仪的临床应用,四、免疫固定电泳 可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。一般用于单克隆Ig增殖病、单克隆Ig病、本周氏蛋白和游离轻链病、多组分单克隆Ig病、重链病、 CSF寡克隆蛋白鉴 别、多克隆Ig病的 诊断和鉴别诊断。,06-20 免疫固定电泳图谱,第五节 电泳仪的临床应用,五、 同工酶电泳 同工酶电泳用于临床上常见的同工酶或同工酶亚型分析。 1乳酸脱氢酶(LD/LDH)同工酶： 2肌酸激酶（CK）同工酶： 3CK同工酶亚型：,06-21 同工酶电泳图谱,第五节 电泳仪的临床应用,六、脂蛋白电泳 脂蛋白电泳检测各种脂蛋白（包括胆固醇和甘油三酯）主要用于高脂血症的分型、冠心病危险性估计，以及动脉粥样硬化性及相关疾病的发生、发展、诊断和治疗（包括治疗性生活方式改变、饮食及调脂药物冶疗）效果观察的研究等。,06-22 脂蛋白电泳图谱,第六节 电泳技术的质量控制,一、电泳分析前的质量控制 （一）标本的采集与保存 （二）电泳分析的选择 （三）电泳试剂的保存 二、电泳分析中的质量控制 三、电泳分析后的质量控制,再见！,