Rho激酶抑制剂与糖尿病心肌病

Rho激酶抑制剂激酶抑制剂 与糖尿病心肌病与糖尿病心肌病 河北医科大学第二医院心内科河北医科大学第二医院心内科 李拥军李拥军 Rho激酶的结构和功能激酶的结构和功能 Rho激酶抑制剂的药理作用激酶抑制剂的药理作用3.Rho激酶抑制剂与心血管疾病激酶抑制剂与心血管疾病4.Rho激酶抑制剂与糖尿病心肌病激酶抑制剂与糖尿病心肌病内内 容容RhoA/ROCKRho为小分子鸟苷酸结合蛋白为小分子鸟苷酸结合蛋白,是是Ras超家族超家族成员之一。成员之一。Rho激酶激酶(ROCK)属于丝氨酸属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激苏氨酸蛋白激酶家族成员，是最早发现的酶家族成员，是最早发现的RhoA下游效应器。下游效应器。ROCK有两个亚基有两个亚基：两者在氨基酸序列上有两者在氨基酸序列上有65%65%的同源性的同源性,其中催化结构域的同源性高达其中催化结构域的同源性高达92%92%。RhoA/ROCK Rho激酶的结构和功能激酶的结构和功能 Rho激酶抑制剂的药理作用激酶抑制剂的药理作用3.Rho激酶抑制剂与心血管疾病激酶抑制剂与心血管疾病4.Rho激酶抑制剂与糖尿病心肌病激酶抑制剂与糖尿病心肌病内内 容容ROCK抑制抑制剂剂目前广泛应用的目前广泛应用的ROCK抑制剂主要有抑制剂主要有fasudil和和Y-27632两大家族。两大家族。它们它们是非亚基选择性的抑制剂，既能抑制是非亚基选择性的抑制剂，既能抑制ROCK1，也可抑制也可抑制ROCK2。主要作用于主要作用于ROCK催化结构域的催化结构域的ATP结合位结合位点上，从而抑制点上，从而抑制ROCK的活性。的活性。较大剂量时亦可抑制其他丝苏氨酸激酶如较大剂量时亦可抑制其他丝苏氨酸激酶如PKA或或PKC。ROCK抑制抑制剂剂Fasudil 19951995年在日本上市，临床上用于治疗蛛年在日本上市，临床上用于治疗蛛网膜下腔出血术后脑血管痉挛。是目前唯一可应网膜下腔出血术后脑血管痉挛。是目前唯一可应用于临床的用于临床的ROCK抑制剂。抑制剂。Hydroxyfasudil是是fasudil的羟化活性代谢产物，的羟化活性代谢产物，其对其对ROCK具有更高的选择性。具有更高的选择性。Fasudil的主要不良反应为肝功能损害的主要不良反应为肝功能损害(7.64%),颅颅内出血内出血(1.63%)和低血压和低血压(0.59%)。但有研究者发现应用但有研究者发现应用fasudil治疗脑卒中与安慰剂治疗脑卒中与安慰剂比较，没有严重的不良事件发生。比较，没有严重的不良事件发生。ROCK抑制抑制剂剂Y-27632是在细胞生物学和是在细胞生物学和药理学研究中广泛应药理学研究中广泛应用的用的ROCK抑制剂。抑制剂。Statins除调脂作用外，还可通过抑制类异戊二除调脂作用外，还可通过抑制类异戊二烯的生成而影响烯的生成而影响Rho蛋白的膜定位功能蛋白的膜定位功能,阻断阻断RhoA/ROCK通路，所以它具有摸拟通路，所以它具有摸拟ROCK抑制抑制剂的效应剂的效应。Statins呈现的多效性很多源于它对呈现的多效性很多源于它对RhoA/ROCK通路的抑制作用。通路的抑制作用。ROCK抑制抑制剂剂ROCK抑制剂的药理作用：抑制剂的药理作用：（1 1）抑制钙敏化效应，扩张血管，改善血管功能）抑制钙敏化效应，扩张血管，改善血管功能 失调。失调。（2 2）抑制炎性细胞的浸润和粘附，减轻炎性反应。）抑制炎性细胞的浸润和粘附，减轻炎性反应。（3 3）减少氧化应激，增加）减少氧化应激，增加eNOS的表达，促进的表达，促进NO生成。生成。（4 4）抑制细胞迁移和细胞增殖，减轻组织重构。）抑制细胞迁移和细胞增殖，减轻组织重构。（5 5）抑制肌动蛋白微丝骨架的聚合和一些基因的）抑制肌动蛋白微丝骨架的聚合和一些基因的表达。表达。Rho激酶的结构和功能激酶的结构和功能 Rho激酶抑制剂的药理作用激酶抑制剂的药理作用3.Rho激酶抑制剂与心血管疾病激酶抑制剂与心血管疾病4.Rho激酶抑制剂与糖尿病心肌病激酶抑制剂与糖尿病心肌病内内 容容ROCK抑制剂与心血管疾病抑制剂与心血管疾病(1)ROCK抑制剂与动脉粥样硬化抑制剂与动脉粥样硬化ROCK抑制剂与心血管疾病抑制剂与心血管疾病（2 2）ROCK抑制剂与冠心病抑制剂与冠心病 Masumoto等发现，对等发现，对冠脉痉挛性心绞痛患者，冠冠脉痉挛性心绞痛患者，冠脉内给予脉内给予Fasudil 可明显减轻可明显减轻Ach诱发的冠状动脉诱发的冠状动脉收缩，防止胸痛发作，而对血压没有明显影响。收缩，防止胸痛发作，而对血压没有明显影响。ROCK抑制剂与心血管疾病抑制剂与心血管疾病 Otsuka等人在为稳定型心绞痛患者行等人在为稳定型心绞痛患者行冠脉造影时，冠脉造影时，首先首先冠脉内给予硝酸甘油冠脉内给予硝酸甘油200gg，而后给予，而后给予fasudil 30mg静脉输注，静脉输注，分别分别测量管腔狭窄处直测量管腔狭窄处直径，发现径，发现fasudil明显扩张狭窄处的管径，其效果明显扩张狭窄处的管径，其效果优于硝酸甘油。优于硝酸甘油。ROCK抑制剂与心血管疾病抑制剂与心血管疾病在日本进行的一个多中心在日本进行的一个多中心期临床试验评估了期临床试验评估了口服口服fasudil对于劳力型心绞痛患者的疗效。结对于劳力型心绞痛患者的疗效。结果显示长期服用果显示长期服用fasudil可以改善患者的运动耐可以改善患者的运动耐力，且存在量效关系。同时患者对药物的耐受力，且存在量效关系。同时患者对药物的耐受性良好，未出现严重的不良事件。性良好，未出现严重的不良事件。新近，新近，Kikuchi等人已将血循环中中性粒细胞等人已将血循环中中性粒细胞上上ROCK的活性作为心绞痛诊断和病情评估的的活性作为心绞痛诊断和病情评估的指标。指标。ROCK抑制剂与心血管疾病抑制剂与心血管疾病（）（）ROCK抑制剂与高血压病抑制剂与高血压病在高血压大鼠模型中，短期给予在高血压大鼠模型中，短期给予Y-27632，能够以剂量依赖的方式显著地降低血压，能够以剂量依赖的方式显著地降低血压，这提示这提示ROCK的激活包含在高血压的发病的激活包含在高血压的发病机制中。机制中。研究发现将研究发现将fasudil应用于高血压病的患者，应用于高血压病的患者，可以增加患者的前臂血流量，降低前臂血可以增加患者的前臂血流量，降低前臂血管阻力，而对正常人血管则没有扩张作用。管阻力，而对正常人血管则没有扩张作用。ROCK抑制剂与心血管疾病抑制剂与心血管疾病（）（）ROCK抑制剂与肺动脉高压抑制剂与肺动脉高压(PAH)研究证实：研究证实：ROCK介导的介导的ECs功能失调功能失调、VSMCs 的的过度收缩和增殖、炎性细胞浸润等过度收缩和增殖、炎性细胞浸润等都参与了都参与了PAH的形成。的形成。Fukumoto等人给等人给9 9例严重例严重PAH患者静点患者静点fasudil(30mg for 30min)，结果发现结果发现fasudil能能够降低肺动脉压力，增加心脏指数，够降低肺动脉压力，增加心脏指数，明显降明显降低肺血管阻力，且未引起低血压等付作用。低肺血管阻力，且未引起低血压等付作用。ROCK抑制剂与心血管疾病抑制剂与心血管疾病 小结：小结：大量动物实验和临床研究表明：大量动物实验和临床研究表明：ROCK抑制抑制剂在防治心血管疾病方面具有巨大的潜力，剂在防治心血管疾病方面具有巨大的潜力，已成为新药研发的热点。已成为新药研发的热点。有更多的研究正在证实有更多的研究正在证实ROCK抑制剂的用途抑制剂的用途及其安全性。及其安全性。ROCK抑制剂的高选择性将会减少其相关的抑制剂的高选择性将会减少其相关的毒付作用。目前正在研发亚基选择性毒付作用。目前正在研发亚基选择性ROCK抑制剂。抑制剂。Rho激酶的结构和功能激酶的结构和功能 Rho激酶抑制剂的药理作用激酶抑制剂的药理作用3.Rho激酶抑制剂与心血管疾病激酶抑制剂与心血管疾病4.Rho激酶抑制剂与糖尿病心肌病激酶抑制剂与糖尿病心肌病内内 容容ROCK与糖尿病并发症与糖尿病并发症 ROCK与糖尿病心肌病与糖尿病心肌病RhoA/Rho激酶信号通路在激酶信号通路在2 2型糖尿病大鼠心肌纤维型糖尿病大鼠心肌纤维化中的作用化中的作用研究背景研究背景糖尿病心肌病是糖尿病一种独特的心脏并发糖尿病心肌病是糖尿病一种独特的心脏并发症。这与糖尿病患者心血管疾病的高发病率症。这与糖尿病患者心血管疾病的高发病率和高病死率密切相关。和高病死率密切相关。心肌舒张功能障碍是其最早出现的临床表现心肌舒张功能障碍是其最早出现的临床表现,最终可发展为心力衰竭。最终可发展为心力衰竭。心肌纤维化是其主要的病理改变之一，心肌纤维化是其主要的病理改变之一，在糖在糖尿病心肌病发生、发展过程中起着非常重要尿病心肌病发生、发展过程中起着非常重要的作用。的作用。对糖尿病心肌病目前尚缺乏有效的治疗措对糖尿病心肌病目前尚缺乏有效的治疗措施，更好地了解其发病机制并发展新的治施，更好地了解其发病机制并发展新的治疗药物是非常必要的。疗药物是非常必要的。国内对糖尿病心肌病的研究主要应用国内对糖尿病心肌病的研究主要应用1 1型糖型糖尿病模型，对尿病模型，对2 2型糖尿病模型的研究较少。型糖尿病模型的研究较少。研究内容集中在形态学改变和细胞因子水研究内容集中在形态学改变和细胞因子水平上，对细胞信号转导通路的研究很少。平上，对细胞信号转导通路的研究很少。研究背景研究背景研究目的研究目的目前，目前，RhoA/ROCK通路在糖尿病心肌纤维化通路在糖尿病心肌纤维化发病机制中的作用国内外未见报道，发病机制中的作用国内外未见报道，ROCK的的下游信号分子尚不完全肯定。下游信号分子尚不完全肯定。研究目的：在细胞水平和整体动物水平，探讨研究目的：在细胞水平和整体动物水平，探讨RhoA/ROCK、JNK和和TGF1/Smad通路在糖通路在糖尿病心肌纤维化中的作用以及相互关系。尿病心肌纤维化中的作用以及相互关系。有可能为糖尿病心肌病确定有效的预防和治疗有可能为糖尿病心肌病确定有效的预防和治疗靶点。靶点。第一部分第一部分RhoA/ROCK通路在高糖诱导通路在高糖诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用原合成中的作用体外研究体外研究细胞培养细胞培养 5.5mM葡萄糖葡萄糖 NG组组 25mM葡萄糖葡萄糖 HG组组 5.5mM葡萄糖葡萄糖+19.5mM甘露醇甘露醇 OSM组组 5.5mM葡萄糖葡萄糖+Fas 50uM NG+Fas组组 5.5mM葡萄糖葡萄糖+Fas 100uM NG+Fas组组 25mM葡萄糖葡萄糖+Fas 50uM HG+Fas组组 25mM葡萄糖葡萄糖+Fas 100uM HG+Fas组组CF proliferation was evaluated using MTT assay.The data are means SD.n=6;P0.01 vs NG group.*P0.05,*P0.01 vs HG group.结结 果果The mRNA expression of type-I procollagen,ROCK1 and JNK was evaluated by RT-PCR.n=3;The mRNA expression of type-I procollagen was significantly upregulated in HG group.结结 果果Immunocytochemical staining for type-I procollagen.Magnification is 400.结结 果果Accumulation of type-I collagen in media was determined by ELISA.The data are means SD.n=6;P0.01 vs NG group.*P0.05,*P0.01 vs HG group.结结 果果 结结 果果 The phosphorylation of MYPT1 was measured by western blot analyses.n=3;P0.01 vs NG group.*P0.01 vs.HG group.结结 果果JNK activity and c-jun protein expression were measured by Western blot analyses.n=3;P0.01 vs NG group.*P0.01 vs HG group.结结 果果 The protein expression of TGF1 and the phosphorylation of Smad2/3 was measured by Western blot analyses.n=3;P0.01 vs NG group.*P0.01 vs HG group.结结 论论 结结 论论高糖激活了高糖激活了RhoA/ROCK通路，介导了心肌成通路，介导了心肌成纤维细胞增殖和胶原合成。纤维细胞增殖和胶原合成。ROCK特异性抑制特异性抑制剂法舒地尔有效地抑制了高糖诱导的成纤维细剂法舒地尔有效地抑制了高糖诱导的成纤维细胞增殖和胶原合成。胞增殖和胶原合成。高糖环境中，高糖环境中，JNK和和Smad2/3是是ROCK的下游的下游信号分子，信号分子，RhoA/ROCK通路介导的胞质信号通路介导的胞质信号部分地通过部分地通过JNK和和Smad2/3转入核内，从而调转入核内，从而调控着相关的基因表达。控着相关的基因表达。第二部分第二部分RhoA/ROCK通路在通路在2 2型糖尿病型糖尿病大鼠心肌纤维化中的作用及法舒大鼠心肌纤维化中的作用及法舒地尔对心肌的保护效应地尔对心肌的保护效应在体研究在体研究2 2型糖尿病大鼠型糖尿病大鼠普通饲料喂养普通饲料喂养10mg/kg i.p.Fasudil治疗大鼠治疗大鼠糖尿病大鼠糖尿病大鼠对照组大鼠对照组大鼠对照组大鼠对照组大鼠SD大鼠大鼠 高脂饲料喂养高脂饲料喂养6w末末STZ30mg/kg i.p.10w末血糖嵌夹末血糖嵌夹24w末结束试验末结束试验 实验设计实验设计结结 果果结结 果果结结 果果Masson staining,Magnification,400结结 果果TEM,Magnification,6000 结结 果果SABC staining for type-I collagen(A)and type-III collagen(B)Magnification,400结结 果果The mRNA expression of type-I procollagen,type-procollagen was evaluated by RT-PCR.n=6;P0.01.结结 果果The mRNA expression of ROCK1,JNK and TGF1 was evaluated by RT-PCR.n=6;结结 果果The phosphorylation of MYPT1 and JNK was measured by Western blot analyses.n=6;P0.01.结结 果果The protein levels of c-jun and TGF1,as well as p-Smad,were evaluated by Western blot analyses.n=6;P0.01.结结 论论糖尿病大鼠发生了心肌纤维化，出现了心脏糖尿病大鼠发生了心肌纤维化，出现了心脏收缩和舒张功能障碍。收缩和舒张功能障碍。RhoA/ROCK通路在通路在2 2型糖尿病大鼠心肌纤维型糖尿病大鼠心肌纤维化中起了重要作用，这可能与它激活化中起了重要作用，这可能与它激活JNK和和TGF1/Smad通路密切相关。通路密切相关。法舒地尔有效地抑制了糖尿病心肌纤维化，法舒地尔有效地抑制了糖尿病心肌纤维化，它对心肌的这种结构性益处不依赖于血糖和它对心肌的这种结构性益处不依赖于血糖和血压的改善。血压的改善。