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细胞免疫功能检测方法 ELISPOT的建立及应用,指导老师： 常维山教授 柴家前副教授 刘永庆教授 报告人：李梅,ELISPOT是什么？,ELISPOT ： 全名为酶联免疫斑点检测。 它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够在单细胞水平检测细胞因子等分泌物的分泌情况 原理可概括为：用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。,ELISPOT检测的优点,灵敏度高：在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。灵敏度高于ELISA 。 单细胞水平：ELISPOT 检测的是单个活细胞的分泌。 操作简便：不需专门的实验仪器设备。可按照标准化的实验操作，可以同时处理数百个样品（Kalyuzhny AE 2005）。,ELISPOT的流程,底板与捕捉抗体的包被,底板类型：硝酸纤维素膜板、PVDF膜板等 捕捉抗体：如抗某细胞因子抗体（Purified Rat Anti-Mouse IFN-r Monoclonal Antibody）。 抗体包被：用无菌PBS（PH9.6）来稀释包被抗体，包被量通常在1-2g/mL（1.25ug/ml ）。 次日倾倒包被液，PBS洗涤数次，在灭菌吸水纸上扣干后，用完全培养基37封闭2h。 倾倒封闭液， 加入检测细胞进行细胞培养。,标准曲线的建立和蛋白含量的确定,olin酚法（20ug/ml-500mg/ml） NDV浓缩抗原作1:25稀释，在650nm波长下比色，吸光度为0.264,带入回归方程式y=629.1x，求得蛋白含量为166g /mL，所以NDV浓缩抗原的蛋白浓度为4150g /mL。,脾淋巴细胞浓度对斑点数的影响,培养时间对斑点数的影响,NDV抗原浓度对斑点数的影响,影响试验效果的其他因素,细胞是否具有活力是试验成功进行的先决条件，凡是活力高功能保持完好的细胞，ELISPOT检测时必定背景干净，阴性对照斑点少，而试验组斑点圆润鲜亮。,在ELISPOT板的移动过程中也要避免ELISPOT板的摇动，否则会造成斑点的分布不均。 在细胞培养完成之前一定要进行严格的无菌操作，试验过程中各步的洗涤工作一定要充分。否则会造成背景的不清晰，针尖样杂斑的增多。,ELISPOT应用实例,跟据间接ELISA结果判定标准（P/N2.1），由表1OD450值可以看出，小鼠免疫后第1、3、5、7天的P/N值分别为1.02、1.33、1.97和2.22，抗体水平呈现逐渐升高的趋势，在第7天才出现抗体阳性。而机体的IFN-水平则呈现先升高后降低的趋势，在免疫后的第三天达最高值，此时分泌IFN-脾淋巴细胞比率177/106。分析可知，在NDV免疫小鼠时，细胞免疫与体液免疫存在着一定的时差关系，在血清抗体阳性检出的前期IFN-的分泌降至最低水平。,应用及展望,白细胞中能够分泌IFN-的细胞为TH2和CTL细胞, 活化条件对细胞内免疫染色IFN和IL-4法检测人外周血Th1和Th2细胞的影响 Th0/Th1/Th2 细胞转换（Th1与Th2细胞亚群均来源于共同的Th0前体细胞，抗原呈递细胞(APC)可活化Th0细胞。遗传因素、抗原类型、剂量、有无佐剂以及抗原进入体内的途径，均可影响APC活化Th0细胞时的微环境，而微环境中细胞因子的类型决定Th0细胞是否分化为Th1细胞或Th2细胞）。 老年哮喘患者外周血淋巴细胞内IFN与IL4的变化 疫苗研究开发：ELISPOT 检测已经成为评价疫苗细胞免疫反应最有效的指标之一（Harrop R et. al., 2004）。对于某些持续性感染疾病，疫苗的细胞免疫保护效果甚至居于主要地位,IL-4可以促进B细胞分化、增殖,在IgE诱导合成中起关键作用4,诱导气道上皮细胞产生内毒素,趋化嗜酸性粒细胞,加重气道炎症5. IFN-与IL-4是相互拮抗的,前者可抑制IL-4的mRNA转录水平,并抑制由IL-4诱导的B细胞合成IgE6. Th1/Th2亚群的失衡,与许多人类疾病有关,多数认为,支气管哮喘中,Th2亚群及所属细胞因子占优势,在该病的发生发展中作用重要2,4.由于CD4+分子,B7-H1/PD-1抑制途径对慢性乙型肝炎患者T细胞免疫功能影响的研究陈良恩中国人民解放军军事医学科学院2007-08-242007博士,突变型乙型肝炎病毒前C-C DNA疫苗的基础研究张敏中国人民解放军军医进修学院2007-07-052007博士,Thanks!,欢迎各位老师同学提出宝贵意见！,ELISPOT与其他细胞免疫检测方法的比较,当特异性抗原和T细胞结合后激活细胞释放出IFN-Y，IFN-YELISPOT可灵敏的检测出T细胞释出的IFN-Y，该方法己被用于多种CTL的检测。Yang.J的研究表明，ELISPOT方法检测CTL不但有高度的敏感性还有高度的特异性和HLA限制性，在用LMP2肽段CLG作为激刺原检测CTL时发现，只有相同HLA型别(HLA-A2)的CDS+细胞能起阳性反应。,