分生实验报告 DNA的限制性酶切与回收

实验五DNA的限制性酶切与回收【实验原理】1. 限制性核酸内切酶是能够识别特异DNA序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA的一类内切酶。其中II类限制性内切酶是重组DNA技术的基本工具酶。经其 切过的DNA有两种不同的切口：平端切口和黏端切口。本实验利用EcoR I和 BamH I对质粒DNA进行双酶切，产生带有粘性末端的DNA片段。粘性末端连接， DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA 可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然 识别不同顺序，却能产生相同末端。平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往 是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用 下连接起来，但连接效率不如粘性末端高。2. 经过电泳的DNA条带需要回收，进一步分离纯化以获得纯度较高的DNA片段。 可先后使用溶胶液，漂洗液，和洗脱液将DNA回收。3. 酶切缓冲液成分及作用： Tris-HCl，维持 pH 在 7.4 8.0； Mg2+内切酶活性所必需； NaCl/KCl，增加离子浓度，利于酶活性； 二硫苏糖醇(DTT)，保护酶，防止二硫键的形成4. 星号活力限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别顺序类似的 序列，这种现象称为星号活力。星号活力出现的原因：酶用量太大 100U / ug DNA酶切体系中离子强度太低，12%):有机溶 剂的存在。5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘 性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为 0.1-0.4ug/ul。6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而 定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。7. 酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大 于10mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限 制酶的活性。8. 要保证酶作用时的最佳反应条件（ph,温度）和底物用量，酶反应才能有效地进 行。9. 高于37C或需长时间保温时，可加入矿物油覆盖在反应液上以减少水分蒸发。10. 反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的 完整。11. 不同厂家的试剂不可混用，需要时请查明相关条件及数据。12. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在 高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲 液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的 循环是可取的。13. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移 及荧光背景的强度，应有选择地使用。14. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时 倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结 果。15. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的 多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔 超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。【实验结果】【实验分析】1. pUC18的凝胶中，右边凝胶条带色浅，混作一团，实验失败，可能是酶活性 不足。左边凝胶条带分割明显，但颜色较浅，可能因为含量较少。或者因为胶失 水过多，或者有碎胶影响其游走。pUC18经EcoR I和BamH I两种酶切之后，预期结果得到21bp和2.67kb两 种DNA片段，本实验则要选取2.67kb作为载体。在marker中，最亮的那条条带 为2kb的DNA片段，2.67kb的目的载体DNA条带片段正好在marker最亮条带的 下方，另一条21bp的片段由于分子量太小，游动快，位于marker的最小条带的 前方，符合实验预期。因此，该凝胶中，左边条带实验比较成功，回收时只需切 割2.67kb的条带即可。2.Sp 1的凝胶中，中间组凝胶中DNA游走不明显，DNA混作一团，可能是酶活性 不足等导致实验失败。而左侧组较为成功，凝胶中的条带分成较为明显的三条条 带，较符合实验预期。切割凝胶时，应选择左边凝胶，但是其在胶最前面仍有小 的亮带，可能是有RNA混杂。而右侧组出现了不应该出现的DNA条带分离，可能 是将SP1和Puc18误混导致。分析原因，DNA由于酶切不完全，大部分DNA没有被切开，导致上样的DNA 样本分子量大，游走缓慢，结果中只有一条明显的条带，与少数不明显的浅条带。 经与marker相比较，左边条带的结果较符合预期。Sp1所在基因经EcoR I和BamH I两种酶酶切得2.2kb和4.9kb两种DNA片 段，2.2kb的DNA片段为目的基因。实验凝胶结果应显示两条明显条带，分别为 2.2kb和4.9kb的两条DNA片段，DNA回收切割时选择较为靠近marker亮条带的 2.2kb的DNA条带片段。