植物组织培养的基本原理.ppt

第三章植物组织培养的基本原理,第一节植物细胞全能性和细胞分化,一、植物细胞全能性（Totipotency）1、植物细胞全能性：1902年由Haberlandt提出，即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。20世纪80年代，认为每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。植物细胞全能性的证明是通过1958年Steward等胡萝卜根段细胞体胚发生试验及1964年Guha等进行的曼陀罗花药培养。,从一个细胞发育成一个植株,2、全能性表达：少数体细胞在发育过程中可能丢失或增加一部分遗传物质,因而失去全能性。如筛管细胞,它在发育过程中失去细胞核,因而没有全能性。由于目前还无法使所有的离体植物细胞都实现其全能性。多数情况下只是分生组织等的细胞能实现。,离体材料在一定条件下仍将按原有的动态平衡关系进行生命活动，表现其全能性。决定(Determination)：植物体是由各个层次或小系统如基因水平、细胞水平、器官水平构成的生命大系统，系统内和系统间协调运行不仅是维持植物生长的先决条件，而且它们的动态平衡关系还制约着其发育进程。全能性表达条件之一：细胞的孤立是诱发全能性表达的重要因素。,脱分化（Dedifferentiation）：已分化的植物细胞要表达全能性,必需先脱分化,使细胞恢复到胚性阶段。生长素尤其是2,4-对脱分化具有重要作用。2,4-浓度高时,诱发不均等分裂；而浓度低时,只诱发均等分裂。一旦发生不均等分裂,细胞就对生长素失去敏感性,在无生长素的条件下能自发形成体细胞胚。,全能相对性的启发在离体培养的选材上，尽可能选取分生组织的部位。将实验目的与外植体生长发育状态(“决定”状态)相结合，创造良好的离体条件。合理使用生长调节物质。,二、细胞分化（Celldifferentiation）,1、概念（1）分化：是指植物体各个部分出现异质性的现象，包括细胞分化、组织分化和器官分化。（2）细胞分化：指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是植株离体再生的基础。,2、植物细胞分化的某些规律和机理,（1）细胞分化基本分为形态结构分化和生理生化分化两类，生理生化分化在形态结构分化之前。（2）分化与极性（Polarity）关系密切。（3）生理隔离或机械隔离在细胞分化中有促进作用。（4）细胞分裂对细胞分化具有重要作用。,（5）植物生长调节剂有明显调节作用。如生长素与分裂素比值，高，促进生根；低，芽。（6）染色体和DNA的变化对细胞分化影响较大。如DNA差异复制。,新种的特征带SSR谱带变异,在DNA水平复制上的差异,细胞分化在DNA水平上的体现,颖果作外植体.愈伤组织分化芽,第二节离体条件下植物器官的发生,一、脱分化（Dedifferentiation）1、概念：也称去分化，指离体条件下生长细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。如叶柄基部的薄壁细胞成为离层细胞；伤害导致局部细胞形成愈伤组织。,机理尚未完全阐明。一般认为脱分化过程中细胞膜透性改变，细胞核增大，内质网范围扩大，多核糖体形成，过氧化物酶增加，蛋白质和酚类物质合成活跃等。,2、脱分化的机理,黄瓜子房组织经脱分化形成胚性愈伤组织,（1）损伤。切割损伤的刺激，促使细胞增殖。（2）在诱导愈伤组织时常加入生长素类，但同时配合细胞分裂素的效果可能更好。（3）弱光或黑暗条件有利于脱分化中的细胞分裂。（4）细胞位置.外植体本身的各类细胞可能对培养条件的刺激有不同的敏感性。（5）外植体的生理状态。不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。（6）植物种类的差异。一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。,3、影响脱分化的主要因素,不同部位产生不同脱分化效果,二、再分化（Re-differentiation）,1、概念：指离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株。（1）细胞水平再分化：首先是细胞壁变厚、假导管细胞的形成，以及酶水平的变化和明显的机能分化，从而形成各种类型的细胞。（2）组织水平再分化：在高水平生长素条件下，最常见的是维管组织（Vasculartissue）的分化.松散的愈伤组织内含大量拟分生组织或瘤状结构；致密的愈伤组织内组织分化很少，大多由高度液泡化的细胞组成。,（3）器官水平再分化：依起源不同，分器官型（Organ）和器官发生型（Organogenesis）。器官型：直接由外植体细胞形成器官原基，继而发育成器官；器官发生型：外植体先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基。,（4）植株再生：根和茎（包括其变态器官）或芽器官的发生可使植株重建。器官发生再生植株的方式大致有：A先形成芽，芽的基部后产生根；B先形成根，根上再出芽；C愈伤组织的不同部位形成芽和根，然后形成微管束组织把两者结合起来.一些变态茎、叶器官，离体培养易于形成相应的变态器官。,2、影响细胞再分化因素：从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获得各种类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是目前，还不能使所有植物的活细胞都再生植株。主要原因是：（1）不同植物种类再分化的能力差异较大；（2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。,三、愈伤组织（Callus）培养,1、愈伤组织形成在脱分化的过程中，多形成Callus,其细胞结构多是异质性的，无明显极性。（1）诱导期：细胞准备进行分裂，细胞大小几乎不变，生理生化变化大，迅速合成蛋白质和核酸。（2）分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞会发生分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。（3）分化期：停止分裂的细胞发生生理代谢变化，出现形态和功能各异细胞。,（1）生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在组织受伤表面形成一层愈伤组织，Callus的细胞数目迅速增多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。（2）质地类型：松脆和致密两种。高浓度生长素，可使Callus变得松脆；高浓度细胞分裂素，则可使致密。（3）生理生化变化：RNA，同工酶谱带，次生物质合成能力，对激素的驯化（1年或继代培养10代以上）。,2、愈伤组织的生长,不同生长素浓度下的愈伤组织形成率,不同类型的愈伤组织及其分化,3、愈伤组织的保持转接,在多数情况下，随着继代培养代数增加和培养时间的延长，Callus长势下降、褐变、分化和形态发生能力下降、降低甚至死亡。主要原因：遗传因素，染色体畸变、基因突变；生理因素，细胞或组织内激素平衡的改变，细胞对外源生长物质的敏感性改变.后者可以通过调控培养条件而恢复。,4、愈伤组织形态发生,（1）过程：外层细胞分裂，逐渐减慢并停止；内部较深处的细胞开始分裂，而且分裂方向也发生改变，形成维管化组织和瘤状结构。（2）形态发生方式：器官发生和体细胞胚胎发生。,愈伤组织的器官发生,愈伤组织的器官发生,愈伤组织的胚胎发生,C白色紧实型愈伤组织;D黄白色松软型愈伤织织:E-F从愈伤织织诱导的胚状体:H胚状体萌发再牛植株,（1）注意松散型愈伤组织，表明晶莹透明的发生过程。（2）如果需要维持生长，应注意愈伤组织的驯化现象，尽量暗培养，可不断地降低降低生长素的浓度。,全能性的表达,