蛋白质组学技术及其在肿瘤特异性分子标记物中的应用

蛋白质组学技术及其在肿瘤特异性分子标记物中的应用摘要：前言随着人类基因组测序工作的顺利完成，人们逐渐意识到仅靠基因组的测序来揭示 生命现象是远远不够的。蛋白质是基因编码的最终产物，是生命活动的真正执行者，只有从 蛋白质水平来研究生命现象，才能从根本上把握生命本质，找到生命活动规律。目前，生命 科学的重点己经从转录组学转移到蛋白质整体水平的研究上来。蛋白组学在提供蛋白质动态 信息方面具有独特的优越性，其中涉及了蛋白质全面综合的结构和数量变化，而这些变化信 息是不能通过基因组学和转录组学获得的。关 键 词：蛋白质组学技术；肿瘤特异性分子标记；转录组学和蛋白质表达之间极其微弱的联系也支持这一观点。尽管人类已经在肿瘤分 子水平方面取得了一些成绩，但在其发病机制及早期诊断方面仍不理想，因此寻找准确、无 创、有效的肿瘤特异性标记物具有重要的临床意义。蛋白质组学的发展为肿瘤标记物的检测 及肿瘤早期正确的诊断提供了新的技术手段。各种疾病的发展过程中往往有蛋白质的动态变 化。肿瘤在其不同的发病阶段，即使在没有任何临床症状的早期，在蛋白质水平方面就已经 发生了变化，而这些被确认在早期发生的蛋白质变化都有可能发展成为临床早期诊断指标。 肿瘤蛋白组学是蛋白组学技术在肿瘤学上的应用，主要就是通过肿瘤发生发展过程中微观的 蛋白质改变去寻找理想的生物学标记。本文着重就蛋白质组学技术及其在肿瘤特异性分子标记物中的应用予以简要综述。蛋 白质组学主要研究技术 蛋白质组”最早是在1995年由MarcWilkinS和KeithWilliamS 在澳大利蛋白质组学技术及其在肿瘤特异性分子标记物中的应用亚Macqua rie大学的分析 生物技术中心所提出，旨在研究一种个体、一个器官、一个组织、一个细胞或者血清及体液 等生理或病理条件下含有的全部蛋白质3。由于同一基因组在不同组织、细胞中的表达情 况不同，即使是同一细胞，在不同的生理状态、不同的发育阶段甚至不同的生长环境下，蛋 白质的表达也各不相同。此外，由于基因组内重组或转录过程中不同的剪接可翻译成不同的 蛋白质，且在蛋白质合成之后又会进行一系列翻译后修饰，比如甲基化、硫基化、磷酸化、 糖基化及酞基化等4。因此，蛋白质组是一个在时间和空间上不断变化的整体。蛋白质组 学就是从整体角度出发，利用不同领域的技术工具，探索和实现对各种蛋白质的分离、纯化 和鉴定，并且融合这些有价值的信息去分析机体、组织、细胞等动态变化的蛋白质成分、修 饰状态、表达水平以及这些蛋白质之间的相互关系，从而揭示和阐明生命活动的基本规律。 蛋白质组学研究主要涉及到两个方面:蛋白质表达模式的研究和蛋白质组功能模式的研究 51。目前主要集中在蛋白质表达模式也即是蛋白质组组分的研究，主要涉及到的技术包括 蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术、生物信息学。蛋白质分离技术主要由双向凝胶电泳、色 谱分离技术及蛋白质芯片技术等。蛋白质鉴定技术主要包括氨基酸分析法、Edman降解法、 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS立、液相色谱电喷雾电离串联 质谱(LC 一 ESI- MS/MS)等。蛋白质组学分离技术双向凝胶电泳系统双向凝胶电泳(2 DE)技术是较为传统的蛋白质组学研究方法，可 以完成对蛋白质的有效分离和半定量分析脸。2一 DE中，第一相是根据蛋白质的等电点差 异，通过等电位聚焦来实现分离的。随后，其第二相则是根据蛋白质相对分子量的不同，采 用十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离。2 DE是目前最常用的蛋白质分离技术， 通常伴随着质谱分析技术共同运用，选取兴趣点之后进行消化，然后运用质谱技术进行分析。 尽管其具有高通量、高分辨率及 高灵敏度等优点，且图像比较容易分析，但该项技术还存 在着诸多局限性。比如费时费力、重复性差，只能检测pH在3.5 一 11.5的范围内且分子 量大小介于10 200kDa之间的变性蛋白质。此外，有些丰度高的蛋白质常常会遮挡邻 近分子量相近的低丰度蛋白质点，导致多种蛋白质出现在一个染色点上，为后续蛋白质鉴定 带来困难。随着 2 一 DE 技术的不断完善，出现了差异凝胶电泳技术。该项技术是将不同的蛋白 质样品分别共价标记上一个不同的荧光染料(cyZ、cy3、cys)，然后混合各标本并在同一 凝胶上进行分析处理，由于不同荧光染料的发光波长不同，经过不同的激光扫描后，就可以 得到不同蛋白质样品差异凝胶图，并能准确测出蛋白质含量。同时，在差异凝胶电泳技术中， 引入了内标的概念，将所有蛋白质样品等量混合后作为凝胶间和胶内对照。分析时，所有蛋 白质斑点均同内标相比较分析其差异值，避免了传统2 一 DE由于凝胶间的变异所导致的差 异，提高了实验结果的可信度。此外，由于荧光染料的敏感度高，在一定程度上减少了工作 量和提高了重复性。但差异凝胶电泳技术并没有从根本上解决疏水性蛋白质、极碱性蛋白质 难以溶解分离及高丰度蛋白质遮挡邻近分子量相近的低丰度蛋白点等问题。色谱分离技术近年来，色谱技术的开展为多肤、蛋白质及其亚基的分离提供了新的方 法。该技术是基于试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和 作用的差异为依据而建立起来的分离方法。按两相所处的状态的不同可分为气相色谱法和液 相色谱法，其中液相色谱法是非凝胶蛋白分离技术中最常用的方法。单纯依靠液相色谱技术， 尚不能满足分离复杂蛋白质复合物的要求。随着液相色谱的不断创新和发展，多维液相分离 系统的出现有效的提高了被测样本的分辨率和峰容量，在一定程度上弥补了单一液相分离技 术的缺陷。此外，多维液相分离技术还具有高通量、自动化、快速及重复性好等优点。目前，常用的多维液相分离系统包括二维毛细管电泳、液相色谱一毛细管电泳等。毛 细管电泳技术作为新近开展的多维液相分离系统，已广泛的应用于蛋白 质的分离。该项技 术是现代微柱分离与经典电泳技术的有机结合，以简化的二维格式对毛细管电泳质谱数据处 理实现可视化，同时可对大型数据组进行同期检测，并对共同迁移的多肤和ESI MS片 段离子完成快速的区分。因此，与经典电泳技术相比，具有散热快、可承受高电压、分离效 率高且可分析分子量范围不适合2 一 DE的样品。此外，毛细管电泳技术还具有快速、灵敏 度高、样本需要量少、成本低、分离范围广及种类多等优点。缺点主要表现在分析复杂样品 时会出现分离不完全的现象。蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是基于基因芯片的设计理念，结合层析、色谱、质谱 等发展起来的蛋白质分析技术。该项技术将检测探针通过一定的方式预先置入固相载体表面， 作为配基的探针在载体表面形成密集阵列，通过与生物样品中的蛋白质结合，能够高通量地 检测蛋白质的生物活性及实现对其定性、定量分析。目前蛋白质芯片技术主要包括蛋白质捕 获和检测两个方面，首先在固相载体表面形成高度密集的探针阵列，当被测样品与该表面作 用时，可捕获样品中特异性的蛋白质，随后固相芯片上结合的待测蛋白质在电场的作用下进 入真空飞行管，根据其飞行时间不同，来检测其分子量和种类。表面增强激光解析电离飞行 时间质谱(SELDI TOF MS)于20世纪九十年代首先应用于生物和医学研究，它代表 了蛋白质分离技术的突破性进展，为检测蛋白质特异表达谱提供了一个敏感、高通量的分析 方法26一281。这一技术的核心即是蛋白质芯片。根据芯片表面修饰物的不同，可分为 化学表面芯片和生物表面芯片。化学表面芯片包括:弱阳离子芯片、强阴离子芯片、亲水性 芯片、疏水性芯片以及金属离子鳌合芯片;生物表面芯片主要包括:抗体一配体、 DNA 一蛋 白质、酶等芯片。根据生物芯片表面蛋白质的理化性质不同，可以选择性地从待测生物样品中捕获目标蛋白质，洗脱未结合的蛋白质，随后加上能力吸收分子，利用激光脉冲辐射使芯 池中的分析物解吸形成荷电离子。离子而z不同，在真空电场中飞行的时间也长短不一，通常质量越轻，相对所带的电 荷越多，飞行时间越短，根据这 蛋白质组学技术及其在肿瘤特异性分子标记物中的应用些 差异，绘制出被测样品的质谱图。最后经软件分析处理，给出受测样品中各种蛋白质的分子 量和丰度等信息。SELDI TOF MS技术与传统蛋白质分离技术2 一 DE相比，具有 以下优势:生物样品如细胞培养液、组织抽取物、血清、尿液、脑脊液、腹水等分析前不 需要特殊处理，可直接进行分析。样品需要量少，血清、脑脊液等仅需0.55微升。 高通量、自动化、操作简便及可快速的获得实验结果。灵敏度高，可检测出2 一 DE不能 发现的低丰度低分子量蛋白质。可同时发现与疾病相关的多种蛋白质，从而为疾病诊断提 供最佳组合模型。将正常健康样本质谱信息与某些疾病患者质谱信息进行差异性对比、分析， 可检测出传统方法检测不到的多肤和蛋白质，对寻找疾病特异性标记物具有重要意义。目前 这一技术主要应用在筛选和确定疾病特异性标记物方面，并取得了一些鼓舞人心的结果，充 分显示了该技术在疾病早期诊断研究中的良好应用前景。尽管SELDI 一 TOF 一 MS技术 在筛选疾病特异性标记物方面具有独特优势，但其也存在一些缺点不能直接对筛选出的目标 蛋白质进行结构鉴定，需要联合一些蛋白质组学鉴定技术，才能实现对筛选出的特异性蛋白 质标记物进行结构鉴定。参考资料1 GoetzJG， JoshiB， LajoieP.Concertedr 铭 ulationoffocaladhesjond” amiesbygalectin 3andtyrosine 币 hosPho 州 atedcaveolin IIJI.JCellBiol, 2008,180(6):1261一12752 LohrM, KaltnerH, LenschM, etal.Cell 一 tYPe 一 sPecifieexPressionofmurine multifunctionalgalectin 一 anditsassoeiati on withfollieula rat resia/luteolysis ineontr astto Pro aPoPtotiegalect ins 一 1and 7 J.HistochemCellBiol, 2008,130(3):5675813 imaJ， LacinaL，DvorankovaB，etal.DifferentialregulationofgalectinexPressionreactivityduringwoundhealinginPorcineskinandineulturesofePidermal eellswithfunetionalimpaetonmi 盯 ationJI.PhysiolRes, 2009,58(6):73 一 844 VladimirovaV， W 自 haA，LuckerathK，etal.RunxZ15exPressedinhumangliomacellsandmediatestheexPressionofgalectin一J.JNeuroseiRes, 2008, 86(11):2450 一 24615 BalasubramanianK, VasudevamurthyR, VenkateshaiahSU, etal.Galeetin 一 3inurineofeancerPatients:stageandtissuesPecificityJ .JCancerResClinOne ol, 2009, 135(3):355363