蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化1.溶菌酶活性的测定采用浊度法，用60mmol/L、pH6. 2的磷酸缓冲液配制一定浊度0450-0. 6-0. 7)的 溶壁微球菌(Micrococcus Lysodleikticus)为底物，取0. ImL酶液加入2. 5mL底物(20C) 中，在波长450nm处读取反应体系3minl勾每隔1 5s的吸光度。以彳45dmin变化 0. 001个吸光度值为一个活性单位。酶活力=4450nm / IminxO. 001 x0. 1mL式中：450nm-lmin内吸光度的变化2阴离子交换柱纯化蛋白是看缓冲液中的盐离子浓度的，PH7.4只是作为缓冲保证蛋白 活性的，你用阴离子交换柱要用盐梯度来洗脱，一般都是氯化钠，从0摩尔开始，逐渐 增加盐的浓度，上限不定3.上样过程是这样的，首先是样品上柱，这时候目的蛋白和一部分杂蛋白都会傍柱的， 这时候出来的是FlowThrough里面应该有不上柱的杂蛋白，接下来在用无盐buffer冲 洗一定的柱体积，会冲洗出一定量结合不牢固的蛋白，然后再用含盐的buffer洗脱，这 一步要逐渐增加盐的浓度，可以拉线性也可以走梯度，一般不会直接用1摩尔的盐洗脱， 应为1摩尔的盐基本上能洗脱阴离子柱上所有的蛋白了。4作酶的纯化时，每一部分，包括穿透峰，都应该做酶活测定，因为在事先是不能肯定 需要纯化的蛋白是否就一定挂上柱了，只有当确定了目的蛋白对某种柱子的结合之后， 确定穿透峰里面没有目的蛋白，才可以不用测定活性。否则就可能带来损失。5.【1】分离胶的浓度和最佳分离范围：(1) SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围(KD)6%胶50-1508%胶30-9010% 胶20-8012% 胶10-40(2) 分离胶浓度()线性分离范围(KD)1512-4310 16-685.057-212【2】浓缩胶一般都是选4%或者5%下面是5%胶的配制方法：成分-配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升)5%胶一一2 -34 6 -8 -10蒸馏水1.4 -2.1 -2.7 -4.1 -5.5 6.830%Acr-Bis(29:1)1.70.330.5 -0.67 -1.0 -1.3 -1M Tris, pH8.8 1.250.25 -0.38 -0.5 -0.75 -1.010%SDS - 0.02-0.030.040.06 0.080.110%过硫酸铵0.02 -0.03 0.040.06-0.08 -0.1TEMED 0.002 0.003 0.004 0.006 0.008 0.016酶液应在-5-20C下冻存，量大的话建议浓缩冻干，若制成酶粉的话可在4C下保藏7对于酶的纯化建议你不要过柱子这样浪费时间又得到的纯品少，用等电点把不同分子量 的酶给分离开，在用冷冻离心机把酶给分离出来，这样快而且酶还不失活。试一试吧。实验室蛋白常用试剂配方来源：生物谷 2008-10-22 访问量：9685 评论(0)分享01、PBS:取ZLI-9061 PBS溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，测pH值应在7.27.4之间，若偏离此范围，请用0.1N的 HCL或NaOH调整。2、TBS：2.1 Tris缓冲液配方：(0.5 M pH7.6)Tris (三羟甲基氨基甲烷)60.57g1N HCL 约420ml双蒸水加至1000mlTris缓冲液配制方法：先以少量双蒸水(300500ml)溶解Tris,加入HCI后，用HCI (1N)或NaOH (IN)将pH调至7.6, 最后双蒸水加至1000ml。此液为储备液，4C冰箱中保存。2.2 TBS 配方：Tris-HCI 缓冲液(0.5M pH7.6)100mlNaCI 8.59g (0.15moI/L)双蒸水加至1000mlTBS配制方法：先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml,充分摇匀。3、枸橼酸盐缓冲液(Citrate buffer)：3.1储存液：A. 0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸(C6H8O7.H20)溶于1000ml蒸馏水中。B. 0.1M枸橼酸钠溶液：称取29.41g枸橼酸钠(C6H5Na3O72H20)溶于1000ml蒸馏水中。3.2工作液：取9ml A液和41ml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值应为6.0 0.14、胰酶(Trypsin)：4.1 ZLI-9011胰蛋白酶消化液：常用浓度为0.125%,即使用前将一滴试剂1胰酶溶液和三滴试剂2胰酶稀释液均匀混合(1:3稀释)，则可直 接滴加使用。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05%(1:10稀释)至0.25%(1:1稀释)。4.2 ZLI-9010胰蛋白酶：取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.05%或0.1% PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。5、胃酶(Pepsi n)：4%胃蛋白酶，用0.1mol/L HCL配制。6、DAB：6.1 ZLI-9032/9033 DAB Kit：使用前只需将试剂盒提供的A、B、C三种试剂各一滴加至1ml双蒸水中，即可获得1ml DAB工作液，简单 易用。6.1 ZLI-9030 DAB：6mgDAB溶于10mlTBS (0.05M pH7.6)，再加入0.1ml浓度为3%的H2O2,过滤掉沉淀物，即可。7、AEC：4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml浓度为0.1M的醋酸缓冲液(pH5.2),然后加入0.15ml 3%H2O2,过滤掉沉淀物。8、RIPA：1xPBS, 1%NP 40, 0.5 sodium deoxycholate, 0.1% SDS (此液体可长期保存)。以下抑制剂以储存液方 式保存，临用前加入RIPA中。8.1 10mg/ml PMSF异丙醇溶液(用量为10 l/ml)8.2 Aprotinin （Sigma 产品，用量为30 l/ml）8.3 1000mM sodium orthova nadate 冷冻液（用量为10 l/ml）9、Blotto A：常规使用 1xPBS, 5% milk, 0.05% Tween 20。10、Blotto B：与Phosphotyrosine抗体共用，1xPBS, 1% milk, 0.05% Tween 20。部分实验中milk可完全去除，但可 能引起背景增高。从牛奶中分离酪蛋白和乳糖一、引言牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合 体胶粒存在，胶粒直径约为20800纳米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后 可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7时，酪蛋白沉淀。脱 脂乳中除去酪蛋白后剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态 的乳糖，乳中糖类的99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。二、实验材料和试剂脱脂乳或脱脂奶粉。醋酸-醋酸钠缓冲溶液（PH=4.7）, 95%乙醇，乙醚，碳酸钙粉末，苯肼试剂。三、实验步骤1. 从牛奶中分离酪蛋白在烧杯中加入2g脱脂奶粉，再加入40ml40C, PH=4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液40ml,用PH精密试纸检验液体的PH值。静置冷却至室温，倾去上层清液（留作分离乳糖用）， 剩下的悬浮液分别装入两支离心试管中，用转速为2000转/分离心分离35分钟，倾出上层 清液，（合并于上一清液中），得酪蛋白粗品。于离心管中加入5ml蒸馏水，用玻棒充分搅拌， 洗涤除去其中的水溶性杂质（如乳清蛋白，乳糖以及残留的缓冲溶液），离心后弃去上层液， 再用蒸馏水洗一次。于试管中加入5ml95%乙醇，充分搅拌，离心后弃去乙醇溶液，用乙醇 洗涤主要是除去磷脂类物质。最后再用5ml乙醚以同样方法洗涤，以除去脂肪类物质。将酪 蛋白沉淀物凉干，称重、并计算得率。2. 从牛奶中分离乳糖在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一 方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。过滤除去沉淀， 在滤液中加入12粒沸石，加热浓缩至35ml，加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少 量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。加塞放置过夜，乳 糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。3. 乳糖成脎试验取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%,在试管中加入lml乳糖溶液，lml苯肼试剂摇 匀，试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇，加热1015分钟后，取出放置冷却, 乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态，可证实为乳糖。苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。硫酸铵沉淀法纯化蛋白的原理和操作及配比用表2010-01-06 13:41:051分类：蛋白质纯化字号订阅今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，这一个步骤是有 名的烦，要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入 硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大, 所带的电子数也多（NH4+, SO42-）,因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离 子水合。蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，水分子会在这些非极性区的表面 聚集，形成类似水笼的构造（请见下图），以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液 加入硫酸铵，后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这 些非极性区之间的吸引，因而沉淀下来。因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就 越容易用硫酸铵沉淀下来。在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站一一硫酸铵计算机这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百 分浓度这四个数值，就可以得到需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增 加的体积，算是一个很不错的网站。此外另一个比较值得提的，是我有用两种方式加入硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵 模碎加入，另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下：1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵 硫酸铵饱和溶液利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质（没试过用倒入 的）。不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了（溶液有致密的白色 气泡产生）。2操作的容易度：硫酸铵饱和溶液 固体的硫酸铵固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶 解的蛋白质很多时，这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分， 要先加热让它饱合后，回到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。3蛋白质溶液的体积放大程度硫酸铵饱和溶液 固体的硫酸铵这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100 ml的硫酸铵百分比从 0%到25%,如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100 ml变成107 ml左右，但若 是加入硫酸铵饱和溶液，会让溶液变成125 ml!而且若是要提高到50%，须加等量的硫 酸铵饱和溶液，所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。因此在加入硫酸铵时，若是低百分浓度可以利用硫酸铵饱和溶液，然而如果是高百 分浓度的，除非不在意蛋白质溶液体积的放大（反正都要离心离下来），否则还是用固体 硫酸铵来的好所以今天从0%拉到25%及从25%拉到50%时，都是利用硫酸铵饱和溶液，但是当 要从50%拉到75%时，我选择利用固体硫酸铵，因为如果用硫酸铵饱和溶液，离心机 无法离那么多的溶液体积。Tris盐酸缓冲液（005M, 25C）50毫升0.1M三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与X毫升0.1N盐酸混匀后，加水稀释至100毫 升。pHX（毫升）pHX（毫升）7.1045.78.1026.27.2044.78.2022.97.3043.48.3019.97.4042.08.4017.27.5040.38.5014.77.6038.58.6012.47.7036.68.7010.37.8034.58.808.57.9032.08.907.08.0029.2三羟甲基氨基甲烷（Tris） HOCH2 CH2OHCHOCH2 NH2分子量=121.14;0. 1M溶液为12114克/升。Tris溶液可从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严。8.