多糖的提取和纯化

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流多糖的提取和纯化.精品文档.多糖的提取和纯化 多糖的提取和纯化多糖的提取和纯化摘 要 本文较详细地介绍了多糖的提取和纯化方法，为多糖的研究和生产提供参考依据。关键词 多糖；提取；纯化；活性炭多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能1：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒2。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用10，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能3-5。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射，增强免疫功能等生物学作用6，麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用7-8，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能9。(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用10，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能11。另外，多糖作为药物，其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们极大的兴趣。 由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。1. 多糖的提取121.1 热水浸提法：1.1.1多糖提取条件的优选根据文献报道13：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选，才能选出最佳提取方案。1.1.2其步骤为：原料粉碎脱脂粗提（23次）吸滤或离心沉淀洗涤干燥首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流13小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1醋酸和1苯酚或0.11M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90100，搅拌46小时，反复提取23次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入25倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）。干燥后可得粉末状的粗多糖。1.2 微波辅助提取法：其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中14。由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清15。聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取18中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46）。1.3 超声辅助法：其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取16。超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点17。1.4 索氏提取法：将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60-90条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60干燥，称重。1.5 醇提法：先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。1.6 其它方法：多糖的提取方法还有稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，因而很多试验中避免采用稀碱液浸提法和稀酸液浸提法。2. 多糖的纯化2.1 多糖中杂质除去方法 粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须分别除去。2.1.1 除蛋白质采用醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖，常混有较多的蛋白质，脱去蛋白质的方法有多种：如选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试剂来处理，但用酸性试剂宜短，温度宜低，以免多糖降解。常用的方法有19：2.1.1.1 沙维积法（Sevag法）20：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂变性而不溶与水的特点，将多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比调为25:5:1或25:4:1，混合物剧烈振摇20到30分钟，蛋白质与氯仿戊醇（或正丁醇）生成凝胶物而分离，然后离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法较温和，在避免降解上有较好效果，但效率不高，如五味子多糖的提取实验中要重复处理达三十几次。并且每次除去蛋白质变性胶状物时，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白，在处理时会沉淀下来，造成多糖的损失。如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用Sevage法效果更佳。2.1.1.2 三氟三氯乙烷法21：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌10min左右，离心得上面水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液，此法效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加530三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止，在510放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降解。Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三种方法均不适合糖肽，因糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。对于对碱稳定的糖蛋白，在硼氢化钾存在下，用稀碱温和处理，可以把这种结合蛋白质分开1。2.1.1.4 酶解法22：在样品溶液中加入蛋白质水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等，使样品中的蛋白质降解。通常将其与Sevag法综合使用除蛋白质效果较好。2.1.1.5 盐酸法23：取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其PH至3，放置过夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀，即脱去蛋白质。另有李知敏23和叶将瑜25等人分别在植物多糖实验中证明：盐酸法、三氯乙酸法及Sevag法脱蛋白率分别为72.5、46.1和42.3，多糖的损失率分别为15.1%、6.1和14.3。盐酸法脱蛋白率高，但多糖的损失率也较高;三氯乙酸法较温和，但除蛋白效率不高；Sevag法的脱蛋白效果不及前两种。2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和饱和Ba（OH）2溶液，振荡后离心去蛋白。此法除蛋白不够彻底，可结合Sevag法使用。还可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉淀完全，在4000r/min的条件下离心10min，收集上清液，即为除蛋白液。还有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白，将混合液清摇，再静置，取上清液。此过程需重复多次方可除尽蛋白。除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验，观察在280mm处是否有吸收，如果无吸收则表明蛋白质已经除尽24。2.1.2 除色素2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素12：活性炭属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特别适合于水溶性物质的分离。它的来源充足，价格便宜，上柱量大，适用于大量制备性分离。目前用于色谱分离的活性炭主要分为粉末状活性炭、颗粒状活性炭、锦纶活性炭三种。一般情况下，尽量避免用活性炭处理，因为活性炭会吸附多糖，造成多糖的损失。2.1.2.2对于植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这类色素大多呈负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA7来吸附色素。2.1.2.3若糖和色素时结合的，易被DEAE纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素可进行氧化脱色：以浓氨水或NaOH液调至PH8.0左右，50以下滴加H2O2至浅黄色，保温2小时。2.1.2.4 依次用丙酮、无水乙醚和无水乙醇洗涤多糖，即可得到较为纯净的多糖。此法较为简单，便于操作，多糖损失也较小。2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素。操作简单，多糖有一定损失。2.1.2.6发酵来源的多糖颜色一般较浅，色素含量较少，一般可不除色素。2.1.2.7对于动物，微生物等提取得到的多糖也可根据不同情况按上述方法处理。2.1.3 除低聚糖等小分子杂质2.1.3.1采用逆向流水透析法。即准备好一桶蒸馏水，用一根导管将水通入透析袋的烧杯底部，另用一根导管将水引出，根据水量控制流速，使水缓慢流动48小时。这样得到的就是多糖的半精品。2.1.3.2利用溶液浓度扩散效应，将分子量小的物质如无机盐、低聚糖等从透析袋渗透到袋外的蒸馏水中，不断换水即可保持浓度差，从而除尽小分子杂质。具体的做法是根据多糖溶液的体积截取相应长度的透析袋，用透析夹夹住一端，灌入多糖液，离液面23cm处夹紧透析袋，置于一大烧杯中，注入蒸馏水至完全浸没透析袋后，用磁力搅拌器慢速搅拌，每12小时换一次水，重复34次。2.2 多糖的纯化方法 纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种：2.2.1 分部沉淀法 根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为了多糖的稳定，常在pH7进行，唯酸性多糖在pH7时COOH是以COO 离子形式存在的，需在pH24进行分离，为了防止苷键水解，操作宜迅速。此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等，然后将多糖衍生物溶于醇中，最后加入乙醚等极性更小的溶剂进行分级沉淀分离。2.2.2 盐析法 在天然产物的水提液中，加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出，与其它水溶性较大的杂质分离。常做盐析的无机盐的有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。2.2.3 季铵盐沉淀法 季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。通常季胺盐及其氢氧化物并不与中性多糖产生沉淀，但当溶液的PH增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高时，也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵盐有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氢氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTAOH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CPOH）。CTAB或CPOH的浓度一般为110（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来，所以控制季铵盐的浓度也能分离各种不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9，而且不能有硼砂存在，否则中性多糖将会被沉淀出来。2.2.4 柱层析：包括纤维素柱层析、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和层析、高压液相层析和其它柱层析。如用活性炭及硅胶做载体的柱层来分离多糖；或用硼砂型的离子交换树脂分离中性多糖。纤维素柱层析 纤维素柱层析对多糖的分离既有吸附色谱的性质，又具有分配色谱的性质，所用的洗脱剂是水和不同浓度乙醇的水溶液，流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最后出柱，与分级沉淀法正好相反。纤维素阴离子交换柱层析 最常见的交换剂为DEAE纤维素（硼酸型或碱型），洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。此方法目前最为常用。它一方面可纯化多糖，另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。般单糖、低聚糖因醛基而发生的颜色反应在多糖上不明显，电泳后常用的显色剂是p茴香胺硫酸溶液（panisidine）和过碘酸希夫试剂等。2.3.3凝胶柱层析 常用的凝胶是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展开剂为0.020.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶与0.02醋酸1：1的缓冲溶液，柱高和柱直径之比大于40。2.3.4旋光测定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度为10左右，离心得沉淀。上清液再加入乙醇使其浓度为2025，离心所得二次沉淀，比较二次沉淀的比旋度。如果比旋度相同则为纯品，否则为混合物。2.3.5其它方法：官能团摩尔比恒定法，即如为纯品两次分离所得产物的官能团如COOH、NH2、SO3H、CHO等摩尔比应该恒定。类似的方法还有示查折射法、HPLC法等。此外德国常用高压液相法来检测多糖纯度，结果可靠。 必须注意的是：纯度检查一般要求有上述两种方法以上的结果才能肯定。转载请保留出处，