乙型脑炎病毒研究.docx

中文摘要目的：流行性乙型脑炎是危害人类健康比较严重的虫媒病毒。尽管目前乙脑的发病率有所下降，但发病区域仍呈现不断扩大的趋势。加强乙脑的监测，就可以评估该地区乙脑的流行状况。蚊子是JEV的主要传播媒介，对蚊子的流行性乙型脑炎病毒和虫媒病毒进行分子流行病学监测，对疾病预防具有防范意义。 方法：首先将云南省景洪县采集15份蚊虫样品研磨接种BHK-21和C6/36单层细胞，待出现细胞病变。提取病毒RNA，并反转录cDNA进行PCR鉴定将目的基克隆到pMD18-T载体，送上海生工测序。同时进行盖塔病毒、辛德毕斯、基孔肯雅病毒的PCR鉴定，回收并测序。在此基础上构建了乙脑基因I型标准质粒，建立了基于SYBR Green I染料的Real-time PCR检测方法，选取Ct值制作标准曲线。结果：乙脑PCR扩增目的基因经测序验证为乙脑基因I型，然后构建应用荧光定量PCR标准质粒。研究建立的标准曲线能够准确定量目的基因，线性相关度很高，呈现良好的重复性，熔解曲线为单一峰型，未出现非特异性扩增。SYBR Green I Real-time PCR与传统方法相比灵敏度要高10倍，而且与猪蓝耳病毒等，均不发生非特异性扩增，具有良好的特异性。结论：鉴定了基因I型乙脑病毒，并构建了快速检测乙脑I型的检测方法。通过实验初步验证了其具备良好的灵敏性和重复性，为以后乙脑的流行病学调查奠定了基础。关键词：乙型脑炎病毒 基因I型 虫媒病毒 荧光定量PCR 前 言乙型脑炎病毒，主要引起病毒性脑炎，每年可导致10,00015,000人死亡，然而乙型脑炎是一个被忽视的热带病。本病容易引发中枢神经系统疾病，临床上以高热、意识障碍、呼吸衰竭等神经症状为特征，具有明显的季节性和地域性。本病的致死率为25-30%，相当一部分为婴儿，50%可造成永久性后遗症。乙型脑炎病毒分布区域已经广泛而且还在不断地向亚洲和大洋洲区域扩展，因此乙型脑炎病毒被认为是新发和再度出现的病原菌。尽管有许多有效的免疫措施，乙型脑炎依然是一个影响全球健康的疾病。乙型脑炎病毒可能是通过野生或者驯养的环境传播前者，主要是野鸟作为扩散宿主，后者主要是猪作为扩散宿主。库蚊，特别是三带喙库蚊，是最主要的媒介。乙脑目前有5个基因型流行，研究发现基因型I已经取代基因型III为主导乙脑病毒基因型。在据报道在1949年中国大陆的报道了第一个JE病例，之后中国有成为亚洲的高度流行区。20世纪50年代以来，100余株乙脑病毒从不同的宿主分离到。因此JE是在中国法律上报告传染病。虽然近年来乙脑的发病率和死亡率均下降，但对于在中国流行的乙脑病毒各地方株之间的差异所知甚少。虫媒病毒由蚊子和蜱传播的疾病。虫媒病毒主要分布于温带、热带和亚热带，世界上大多数地区都有虫媒病毒的分离。虫媒病毒引起诸多症状如全身性发热、关节炎、出血和脑炎等, 甚至导致神经麻痹及损伤，严重的还可以引起死亡。虫媒疾病的发病率一般随季节性变化，受温度或降雨的波动影响及脊椎动物宿主丰富程度。疫情发生则是当环境条件有利于虫媒病毒传播周期内显著扩增。近年来随着中国与东盟等国家的贸易、旅游等活动的进一步发展，中国存在着虫媒病毒暴发的风险本研究选取在云南省报道过的虫媒病毒，盖塔病毒、基孔肯雅和辛德毕斯，进行分子生物学调查和病毒分离。 文献综述1 乙型脑炎病毒的研究进展流行性乙型脑炎（乙脑）又称日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是由蚊子传播的病毒性脑炎疾病，严重危害人类的健康。过去的几十年，动物传染性疾病（由野生或饲养动物传染给人）的发病率显著增加了70%或更多1。乙型脑炎病毒作为为亲神经的黄病毒科黄病毒属成员，可通过蚊子将病毒从动物传播给人。在人类中，这种人畜共患疾病在世界范围内引起流行性病毒性脑炎，影响中枢神经系统（CNS) 2-3。有关乙型脑炎的发病机理和本病的临床表现（包括严重的神经症状）的一些因素已被深入研究4-5。本病潜伏期为5-15天，乙型脑炎的致死率为25-30%，相当一部分为婴儿，50%可造成永久性后遗症。1871年在日本，乙型脑炎第一次发现 6。尽管1941年研究出了有效疫苗，而且随着的国家性的免疫措施大大降低了乙型脑炎的发病率，但仍有一些零星感染事件发生，而且在南亚，东亚，东南亚以及大洋洲地区仍旧广泛地传播7。目前，超过30亿人生活在乙型脑炎流行的国家。虽然所有年龄段的人都可能感染乙型脑炎病毒，但儿童乙型脑炎的发病率更高，这主要是因为大部分成年人具有免疫力8。目前，每年大约有68000例乙型脑炎，至少导致10000-15000人死亡9-10。1.1乙脑基因结构日本脑炎病毒是黄病毒科家族成员，是单股正链RNA病毒11，外面有衣壳包被, 呈二十面体结构。乙脑基因组大约11kb，包含一个开放阅读框（ORF）编码的蛋白。整个基因组编码三个结构蛋白（C，M，E）和7个非结构蛋白（NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b，NS5）。非编码区（5和3）在开放阅读框的两侧，顺序为：5-C-prM/M-E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3。C蛋白结合RNA形成衣壳12。PrM与E蛋白形成异源二聚体，直到病毒被释放13。在病毒粒子释放之前，PrM 蛋白是由furin-like蛋白酶来切割形成成熟的（M）蛋白。与E蛋白结合形成二聚体从而被激活。糖基化包膜蛋白（E）和膜蛋白（M），形成二十面体衣壳嵌入在磷脂双分子层14。E蛋白是较大的结构蛋白，有500个氨基酸和两个潜在的糖基化位点组成。这些抗原域已经通过X射线晶体学鉴定15。E蛋白参与许多重要的生物学过程，包括血凝、病毒中和、病毒颗粒组装。硫酸乙酰肝素分子最近已确定为黄病毒进入细胞的受体。病毒进入宿主细胞通过内吞作用。随后的脂质膜与内吞体膜的融合让病毒RNA渗透到感染细胞的细胞质中。E蛋白在毒力表型中起主要作用并且单个氨基酸取代可能造成嗜神经毒性的丢失。在一项关于RP9（强毒）和台湾乙脑分离（NT109）（减毒株）的R2（弱毒株）表型差异的研究发现10，这种差别归因于在E蛋白的不同，E蛋白138位RP9为Glu，RP2为Lys，其他的差异在于PrM蛋白第43位氨基酸RP9为Tyr，RP2为His。因为PrM N末端92个氨基酸被裂解并且不存在于成熟的JEV病毒粒子，因此认为E蛋白改变第138位置单一氨基酸导致其毒力的差异。非结构病毒蛋白为乙脑病毒的复制提供功能性监管酶。 1.2乙型脑炎病毒的基因型及进化1.2.1基因型通过对C/PrM和E（衣壳，前体膜和囊膜）基因进行核酸测序，已经鉴定出五种乙型脑炎病毒的基因型。基因I型大多数病毒株分离自泰国北部，柬埔寨和韩国; II型分布在泰国南部，印度尼西亚，马来西亚和澳大利亚16-17; III型分布在亚洲的大部分是温带地区日本，韩国，中国，台湾，菲律宾，印度和斯里兰卡;IV型分布在印尼东部; V型仅限于马来西亚18，但最近在中国和韩国发现了该型的分离株。IV型和V型是乙型脑炎病毒最古老的家族成员，他们起源于印度尼西亚-马来西亚地区。因此，乙型脑炎病毒最初的传播可能来源于此。乙脑I型，II型和III型流行最广泛，占到1935年-2009年间所分离病毒株的98%19。1.2.1病毒进化 直到现在，影响乙型脑炎基因型的历史，出现和传播的地域因素尚未十分清楚。事实上，基因型的出现和传播似乎与环境因素有关20。在一些从来没出现过乙型脑炎的地区（例如，在西藏，这被认为是无乙脑病毒的寒冷和高海拔地区出现了V型乙脑病毒的基因型，在澳洲出现了I型脑炎病毒）现在也被一些优势基因型代替了（比如III型向I型转变）21。这些变化被认为是日本乙型脑炎病毒找到了一个新的合适的载体或者宿主有关22。更有可能的是与环境因素（例如，澳大利亚蚊通过风传播），动物生态学（如动物的迁徙），人类活动（例如I型乙型脑炎病毒通过生猪贸易传入澳大利亚），气候变化有关，他们可能影响着日本乙型脑炎病毒的分布和基因型的产生。1.3乙型脑炎病毒的流行病学1.3.1分子流行病学最近亚洲温带地区的流行的基因型主要是I型和III型，而热带地区的流行的基因型主要是II和IV型。因此有人推测乙型脑炎病毒的流行病学差异可能与基因型有关23。然而，最新的发现表明基因型可能与流行病学或流行区域无关。的确，大洋洲的热带地区分离到乙脑I型，II型在1970s之前在韩国的温带地区流行24-25，目前III型仅在印度出现主要在南印度岛（流行性）和北方流行（地方性）26。 乙型脑炎病毒基因组的差异也许可以解释本病的表型变化。在实验室中对E基因的改变，发现与老鼠和猴子神经侵染性和神经毒性的丧失和获得有关。尽管如此，有关乙型脑炎病毒野生株对小鼠神经毒性的实验表明并不存在明显的基因型-表型关系27-30。因此仍然没有确凿的证据表明乙型脑炎病毒基因型的流行在毒力上有所不同。然而，另一个与黄病毒相近的登革热病毒2型被证实存在这种基因型依赖性特征31，如对人病毒性致病性和埃及伊蚊肠病毒性复制。到目前为止，对乙型脑炎病毒分子标志的研究仍不够充分，有待于进一步研究32。乙型脑炎病毒流行病学模式似乎由一系列复杂的因素包括环境，生态和免疫因素所影响的，而不是仅仅由病毒遗传因素所决定的。1.3.2空间流行病学乙型脑炎病毒的分布区域一直在扩大。有时，乙型脑炎病毒分离株的基因型会发生地方性地改变。有报道称在越南和泰国的北部，存在II型和I型的转变33。在北温带地区（如日本，南朝鲜和中国东北），I型逐渐地取代了III型而且变成了主要的基因型34。基因I型很可能是目前亚洲最流行的基因型，而且发现其对人类是致命的35。然而，迄今为止仅有基因III型株的疫苗，这些疫苗对各种流行基因型，变种和基因型的交叉反应中和抗体的保护水平需要进一步的研究36。特别是对基因I型的免疫应答不明显，持续时间有待解决。1.4传播媒介超过30种蚊子（属于伊蚊，疟蚊，阿蚊，库蚊和曼蚊属）是潜在的能够携带乙型脑炎病毒的37，但并不是所有的蚊子都能够传播病毒。不同蚊子种属之间或内部的敏感性有差异，而且可能与基因型具有协同性，这在登革热和基孔肯雅热病毒中已经发现出来38-39。不同种蚊子对不同基因型的乙型脑炎病毒的感受状态和传染性没有变化，这已经被证实。库蚊是乙型脑炎病毒最强的媒介，同样伊蚊是登革热病毒的最强媒介40。媒介的生态，特别是宿主取食的偏好性可以解释病毒对媒介低的可塑性，因为很少蚊子以乙型脑炎病毒宿主为食。例如，澳洲大陆的环纹库蚊是乙型脑炎病毒的主要媒介，主要以有袋目动物为食，以此保持乙型脑炎病毒的传播循环41-42。乙型脑炎病毒的传播主要通过 环纹库蚊，环面蚊，棕头库蚊，杂鳞库蚊复合群以及水稻种植区的三带喙库蚊43。三带喙库蚊是乙型脑炎病毒的主要媒介，因为其具有较强的敏感性，而且在乙型脑炎病毒流行的地区广泛分布44。乙型脑炎病毒的媒介具有很高的嗜血性，尤其对禽，牛，猪和人类45。因此，媒介的摄食偏好性是影响病毒适应性的主要生态因素。感受能力的变化可能是由于蚊子肠内和唾液腺感染的敏感性差异，因此病毒的分泌和传播的效率存在差异。对乙型脑炎病毒的易感性可能部分依赖于病毒的E基因序列46。该基因编码的一个蛋白，首先参与病毒通过附着细胞膜受体进入细胞过程，然后参与乙型脑炎病毒和宿主细胞膜融合过程47-48。尽管针对这一问题有一些研究，但没有数据证明针对不同基因型乙型脑炎病毒的各种蚊种媒介的感受能力和传播能力有重要变化。根据媒介飞行范围内病毒血症分析，宿主对病毒的生态学也起到重要的作用，最终，我们可以得到乙型脑炎病毒的传播循环类型：一种是与鸟相关的野生循环，一种是和猪有关的农村驯养循环。1.4.1与鸟相关的野生循环虽然在野外多种动物（蝙蝠，鸟类，啮齿动物，蛇，野猪）可能感染乙型脑炎病毒，一些哺乳动物和鸟类有较高的血清阳性率，但他们都是终末宿主而且无法感染蚊子。但是，超过90种鸟类是已知的乙型脑炎病毒的放大和储存宿主。其中，野生禽，特别是鹭科家族的白鹭和苍鹭极易受到乙型脑炎病毒感染。它们代表了主要有效的动物宿主，具有高的病毒效价，而且它们是蚊子感染的主要来源。由于它们大部分广泛分布而且能够迁徙，因此鹭科物种被怀疑是病毒的来源。野生动物物种被认为是替代乙脑病毒循环的一部分：在新加坡野猪被怀疑是散发的人类JE病例来源，在日本野生哺乳动物（浣熊，野猪，貉）和澳大利亚飞狐检测到乙脑抗体反应呈阳性49-51。在中国，乙脑病毒从两个蝙蝠中分离到。在野外循环周期中，乙脑媒介传播模式更可能与给定的环境有关。在这个周期的附近人类有可能被意外感染53。1.4.2农村圈养猪的生活周期在农村，牛，鸡，狗，鸭，羊，马，猪的生活周期中都有可能感染乙脑病毒，但只有其中少数能使病毒有效扩增。猪作为主要的病毒扩增宿主。其他一些圈养的哺乳动物（牛，狗，山羊）也跟猪一样显示了高血清阳性率。然而，病毒在猪的体内具有快速复制的能力，从而，猪具有最高的病毒血症54。由于在东亚和东南亚集约化生猪养殖，猪是圈养周期的主要组成部分。特别是，这几十年在许多国家（中国，缅甸，泰国，越南）生猪养殖已广泛发展起来，产业化提高了乙脑病毒在存栏生猪体内的扩增的效率，从而促成提高乙脑病毒传播的风险。因此，人类和牲畜之间的高接近成为人群感染的主要的危险因素55。圈养宿主和病原体之间的相互作用取决于几个因素56，比如，宿主基因，生理条件，农业等等。首先，对于许多疾病，牲畜的抵抗力和耐受力有遗传的因素，包括品种的遗传性状。而宿主对感染的抵抗力限制了病原体在群体中的传播和维持，耐受力反而不限制病毒传播。用外来物种（大白，长白，杜洛克）代替本国物种有可能改变家养猪对日本乙型脑炎的易感性57。然而，还缺乏证据说明本土猪和引进猪对乙型脑炎增殖作用的能力是否有差别。其次，不同的养殖场之间的生猪易感性取决于生理条件和农业要素。第三，农场里面循环淘汰猪的强度由农场所饲养量，屠宰它们的年龄，繁殖率和接种工作决定。乙脑病毒在圈养宿主体内的流行病学受多因素影响的复杂的模式，这种模式有待研究58。蚊子存在于野生传输周期也大大影响其在农村生活周期59。虽然大多数蚊种通常食用鸟，牛，和猪血，然而巧合的是这似乎也是由于蚊子经常以猪场的废水处作为繁殖的场所60。因为蚊子显示出自然携带乙脑病毒的能力，也显示出传播病毒的能力。库蚊是另一个有潜在传播日本乙脑病毒的能力的媒介61。它代表了感染人类的重要潜在来源，它在继城市化和人类扩张之前未出现，而在一些城市家庭与人口密集和饲养猪的地方数量剧增。1.5 影响JEV流行病学主要因素1.5.1环境因素 虫媒和人畜共患疾病的（再）出现，以及疾病变化的风险和发病率的强度受环境因素的推动。其中最相关的因素是气候，土地覆盖率和土地使用情况，人的活动和对地球表面的生物物理属性都有影响62。然而，这些变化出现在许多不同的地理范围。长期以来，乙脑流行病学调查在全球范围讨论主要针对气候变化（如降雨和温度），因为它们严重影响传播病毒的载体的密度。最近，米勒等人确定雨季中有利于库蚊的最佳的温度范围63。他们还发现，大部分乙脑病例发生在携带它们的媒介密度高的地方，同时他们还强调气候变化，媒介生态学和人类健康的联系。此外，温度也许会影响媒介的基因型从而影响携带病毒的能力，如西尼罗河病毒64。 在以前的研究中，各个大洲是根据他们的人类起源，生物，地理和物理因素，气候条件，生物群落和土地使用来划分的。对乙脑病毒基因型的地区历史进行了分析（即乙脑病毒的分离数和各基因型的比例）。然后，发现乙脑传播比较密集的两个区域：首先是古北生物地理的区域（包括俄罗斯东部，日本，韩国和中国北方),还有就是种植了许多水稻的热带地区包括印度支那半岛（柬埔寨，老挝，缅甸，泰国和越南），中国南方，台湾。 事实上，土地覆盖和土地利用变化已经带动日本乙型脑炎发病风险。在亚洲，自上世纪60年代初种植水田面积不断上升65。稻田、养殖场地也吸引了不少涉水鸟类觅食和休息，养殖场加强流蚊子的繁殖和扩大了涉水鸟类种群。因此，在一些水稻灌溉广泛的农业地区，乙脑病毒传播可能变得不那么依赖于降雨。 同样，由于自1960年以来生猪的头份有所增加，工业化的养猪场已经为蚊子提供了一个持续增加的，有潜力的“餐源地”66。 此外，更精细的尺度空间分析，有助于更好地了解环境结构如何影响乙脑流行病学。 一旦乙脑被引进，其生态可持续性的确依赖于其易感宿主群体的生长，并通过载体向宿主传播。然后，偶然感染到人类的危险性取决于周围的环境中疾病传播的可能性。要把疾病传染给人类需要67：1、携带病毒的蚊子作为媒介；2、能使病毒有效储存并繁殖扩增的宿主；3、在携带病毒的媒介和病毒储存宿主之间有免疫力低下的人群。在这个过程中，三大环境要素分别是是水田，养猪场和人类居住地。周围环境的排布是决定媒介到底是靠近还是远离人类的重要因素68。在给定的环境中，这种生物之间的接触很可能有力地影响着乙型脑炎传播的力度。 1.5.1非环境因素 疫苗接种是减少乙脑在人体中的发病率的最有效方式，但其对JEV传播没有影响。家畜，特别是猪，接种减少了病毒的扩增，降低蚊子感染的比率，随后也降低了对人类感染的危险69。此外，对猪的监测可以预测日本乙型脑炎在附近人口爆发的可能性。其他因素也强烈地影响着日本乙型脑炎病毒的传播，无论是幼小或感染动物的运动，如飞翔的脊椎动物的迁移、家畜的贸易和运输。这些运动使人类暴露于乙脑病毒之中，因此需要卫生系统的特别关注。 在东南亚，活畜交易发生在农场之间，在当地的市场，更重要的是在印度支那半岛和中国之间，同时还有香港和新加坡70。比如，有病毒血症的鸟类，可能是将乙脑病毒传播到印度，台湾，巴布亚新几内亚。候鸟有可能是日本乙型脑炎病毒的传播者。然而，主要的水禽活动传播乙脑病毒的模式还鲜为人知。 此外，乙脑可通过风吹分散感染的蚊子来传播，这被认为是乙脑病毒从巴布亚新几内亚传播到澳大利亚北部，从中国传播到日本的途径71。此外，也没有证据表明，乙脑需要一个从鸟生长周期传播到圈养猪生长周期适应的过程。如果野生和圈养宿主同时在有带毒的媒介的地方密切接触的话，乙脑病毒是很容易从一个宿主传播到另一个宿主。1.6发病机制感染的蚊子叮咬后，病毒在进入中枢神经系统前，病毒在外周扩增产生的瞬态血症。周边扩增的部位先是真皮组织，然后淋巴结。JEV跨越血脑屏障的机制目前不清楚。在实验利用仓鼠模型的研究，圣路易斯脑炎通过嗅觉进入中枢神经系统路线。鼻内喷雾也是猴子感染乙脑的有效途径。人类的免疫组织化学染色尸检标本表明大脑的感染提示有出血点。在实验模型中，黄病毒可以在内皮复制，并可能穿越血-脑屏障72。在JEV中，被动转移跨过内皮细胞是其有可能的机制。其他的因素可能导致破坏血液-脑屏障，导致如脑膜炎，头部外伤和脑囊虫病共感染可能增加JEV的嗜神经的风险。许多研究报道严重的日本脑炎与过高的数量的囊虫共存的现象73。电子显微镜研究感染的小鼠的脑发现病毒的复制是在粗面内质网和高尔基体。JEV侵入神经元后形成血管周围袖套，浸润炎症细胞和感染细胞。死亡病例脑部血管周围袖口T细胞针对CD8+和CD8-单克隆抗体74。这两种类型的细胞被发现在中枢神经系统急性感染病例。在急性死亡病例，炎症的病理组织学证据可能没有，但免疫组织病理学研究发现病毒抗原存在于形态正常的神经元。这也许可以解释在一些严重JE患者发现正常的CSF 75。1.7免疫JEV感染后发生体液和细胞免疫应答。原发感染（第一次感染JEV），数天内在血清和脑脊液产生快速和有效的IgM反应。到了第七天，所有的患者IgM抗体滴度都得到提高。通常该病毒不能分离到；然而IgM应答失败导致病毒分离和致命的结果76。在病毒穿过血脑屏障前，乙脑病毒抗体在病毒血症期通过限制病毒复制保护宿主。从其他黄病毒感染证据表明，乙脑抗体降低损害通过中和细胞外病毒和通过抗体依赖的细胞毒性作用裂解感染的细胞。在生存患者，免疫球蛋白类发生转化; IgM抗体下降，IgG抗体开始上升，30天大部分患者血清中IgG能对抗乙脑病毒。无症状感染乙脑病毒也有血清中IgM的升高，但脑脊液并没有升高。在患者继发感染，或已经感染了不同黄病毒，有一个共同的黄病毒组抗原回忆应答。此抗体活化的次级模式的特点是一个IgG的早期崛起与后续IgM抗体的缓慢上升77。入侵中枢神经系统之前，细胞免疫应答通过限制病毒复制预防疾病。无胸腺裸鼠增加了JEV易感性。免疫接种弱毒的小鼠脾细胞能转移免疫性感染。通过血液输入JEV，JEV复制能抑制的动物的大脑。有报道说，艾滋病患者较容易形成路易斯脑炎风险，可能是细胞毒性T淋巴细胞可能在清除和控制乙脑病毒中起到重要的作用，这种现象已经在流感，HIV和登革病毒感染见到。在7天恢复期JE患者和JE接种，T细胞应答均出现应答。 T细胞的增殖，包括CD4+和乙脑病毒特异性CD8 +T淋巴细胞。乙脑病毒的特异性和黄病毒交叉反应性CD4 + T淋巴细胞识别E蛋白。神经元损伤和JE宿主防御已被归因于大量的促炎细胞因子和趋化因子的数目78。在乙脑感染，小胶质细胞和星形胶质细胞的活化是一种常见的人类和动物研究的组织学特征。活化的小胶质细胞和星形胶质细胞分泌的细胞因子吸引炎性细胞。趋化因子在中枢神经系统中发挥重要作用。细胞因子如IFN /，IFN-?和TNF-激活抗病毒途径的之后，他们结合到感染细胞的表面病毒受体。在JE患者血浆和脑脊液中检测到内源性干扰素（INF a）。其它细胞因子，如IL-1的/，IL-2，IL-6，IL-12，IL-13和IL-18被认为是抗病毒反应。在另一方面，它也已表明，细胞因子在发挥免疫调节反应和炎症反应的同时，但某些细胞因子如IL-1和TNF-还可以有直接的细胞毒作用。在JE研究中发现，死亡与存活病例中脑脊液肿瘤坏死因子，IL-6和IL-8较高。此外，在病毒中枢神经系统感染动物模型已证实，Th2应答其特征是IL-4生产似乎具有保护作用，而Th1细胞其特征在于，IFN-?反应有利于激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞，从而产生促炎细胞因子和活性氧和氮中间体。该机制该规范的表达，不同的细胞因子的释放是密切相关的。肿瘤坏死因子诱导IL-6和TGF的表达。同样地，IL-1可诱导的IL-6，肿瘤坏死因子和TGF表达。而TGF抑制肿瘤坏死因子的生产。2 总结与展望乙脑依然是危害人类健康的虫媒病，特别是南亚和东南亚的一些国家和地区。目前缺乏有效的治疗，只能进行支持疗法和对症治疗。因此必须采取预防措施控制蚊子数量，改善环境。加强科技和卫生事业的发展，同时寻找积极有效的治疗措施和免疫策略来预防此类疾病。 第一章乙脑基因I型的分离和鉴定1 材料与方法1.1 材料1.1.1 蚊虫样品采集时间和地点2013年夏季7-8月份进行蚊虫标本的采集，每天采集时间段约为晚间20:00-次日6:00,时间跨度12小时左右，基本覆盖夜间蚊虫活动高峰。采集地点为云南省景洪市东风农场。1.1.2 采集工具诱蚊灯购自武汉市吉星环保科技公司；交通工具(车辆)、雨衣、雨鞋；蚊虫分类用镊子、放大镜、记号笔、记录本；冻存管、医用胶布。1.1.3 蚊虫标本的处理采集地点多选择选择房屋、牛羊圈舍周围以及猪养殖场等蚊虫聚集区域。蚊虫标本的处理收集网置于-20冰箱中冷冻30min，将蚊虫冷冻死亡后，取出收集。1.1.4 蚊虫标本的分类和运输蚊虫倒在白瓷盘中开始分类,蚊虫计数。按蚊种的不同分别装入冻存管,每只管内装1000只，并将管子外进行编号，编号1-13、15为三带喙库蚊，14号为杂蚊和中华按蚊子；蚊虫装入冻存管后立即放入-20冰箱内,收集完成后放入-80中保存。1.1.5 病毒分离用细胞C636细胞、仓鼠肾细胞(BHK-21、DH5感受态由本实验室保存提供。1.2 方法1.2.1 引物设计根据文献报道的云南省设计了乙脑引物。如下表所示：引物名称Primer names引物序列Primers Sequences产物大小/bpProduction length位置GeneJEV NS1DJEV NS2U5-CAAGTTTACAGCATTAGCCCC-3 5- ATGCCACTTCCACACCTCATC -3429bpNS1乙脑病毒PCR鉴定的反应体系：模板5l，2Mix Buffer 12.5l，H2O 4.5l，上游、下游引物各1l，总体系25l。反应条件：94变性30s，60退火30s，72 30s，共35个循环，最后72延伸10min。1%琼脂糖凝胶跑电泳。1.2.2 蚊虫样品研磨将15份蚊样品编号为1-15。加800uL 双无DMEM到-80冷冻的研钵中研磨，研磨成匀浆。将研磨液吸入EP管中，412000r/min离心10min。吸取上清液放-80冰箱保存。1.2.3 单层细胞的制备取长满单层BHK细胞，弃去原液，加入1mL无血清DMEM洗涤弃去。加1mL胰蛋白酶消化细胞，置37恒温箱内1分钟。然后加入细胞液重悬细胞。细胞计数后，以6105个/mL传于新的6孔细胞培养板。每孔补足细胞生长液至2mL，置于37 5%CO2培养箱内培养。取长满单层C636细胞弃去原液，加入1mL无血清1640洗涤弃去。加1mL胰蛋白酶消化细胞，置37恒温箱内1分钟。然后加入细胞液重悬细胞。细胞计数后，以6105个/mL传于新的6孔细胞培养板。每孔补足细胞生长液至2mL，置于37 CO2培养箱内培养。1.2.4 病毒分离样品研磨液上清100uL加入900uL培养基，接种于生长旺盛的BHK-21和C636单层细胞，吸附2h后加入2%维持液，置于5%CO2 37培养，每隔12小时观察一次，一般2-3天出现细胞病变。1.2.5 病毒RNA提取 样品研磨液上清200uL进行总RNA提取，按上海生工总RNA试剂盒说明书操作步骤进行。操作过程：加入500L TRIzol裂解液，颠倒混匀放置10min；加入200L氯仿，剧烈振荡30sec，放置3min；412000r/min 10min；吸取上层水相于干净离心管中，加入250L无水乙醇，混匀后放入吸附柱中，静置3min，12000r/min 3min；弃滤液，加500L RPE Solution，静置2min，10000r/min离心30sec，弃废液，重复一次后将吸附柱放入收集管，10000r/min离心2min；加入30L DEPC-treated ddH2O 3 min，12000r/min离心2min，将得到RNA反转录。反转录步骤：取13uL RNA依次加入1L DEPC ddH2O和1uL Primer(9mers)后放入 75 水浴5min，再迅速冰浴采用8-10min；反转录体系5.5L DEPC ddH2O、6uL 5RNA PCR Buffer、1.5uL dNTP (10mmom/L)、RNase和M-MLV反转录酶各1uL，42水浴2h，75灭活15min，即获得cDNA，-20保存。1.2.6 病毒的RT-PCR鉴定利用得到cDNA为模板，进行引物的PCR鉴定。1.2.7 目的基因的克隆样品RT-PCR鉴定为阳性样品的经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的处片段并与pMD18-T载体连接。16 12h；转化DH5感受态冰浴30min，42热激90s；冰浴8-10min，加入800L无抗性LB； 37摇床，240r /min，60 min；6000r/min离心1min，弃上清后，50L菌液吹打均匀后均匀涂布于含Amp抗性的LB平皿中；3712后挑取单个菌落。1.2.8 重组质粒的小量提取挑取单个转化菌落接种于含氨苄抗性LB液体培养基中，37振摇(220rpm)培养12h后。提取质粒按照质粒DNA小量试剂盒说明书操作。过程如下步骤：收集3次菌液于Ep管中12000r/min离心1min，弃上清加250L Buffer S1溶液，悬浮均匀；加250L Buffer S2溶液，温和的上下颠倒46次；立即加350L Buffer S3溶液，上下颠倒68次，12000r/min 10min。转移上清到吸附柱12000r/min 1min；加500L Buffer W1溶液12000r/min 1min；弃滤液加700L Buffer W2溶液12000r/min离心1min，重复一次；空离12000r/min离心2min，最后加50L Eluent 洗脱液，1min，12000r/min 1min，-20保存。1.2.9阳性质粒的PCR鉴定和测序阳性质粒DNA进行PCR鉴定。取10uL产物在1%琼脂糖凝胶进行电泳。将经PCR鉴定阳性质粒进行序列测定，由上海生物工程公司完成。 2 结果 2.1 细胞病变在单层BHK-21细胞接种蚊悬液样品的上清液2天后，细胞开始变圆、脱落，见(图1、图2)。在单层C6/36细胞接种蚊悬液样品的上清液2天后，细胞开始变圆、脱落，见(图3、图4)。2.2 蚊虫研磨样品RT- PCR鉴定结果研磨后提取的RNA反转录成cDNA为模板，进行乙脑的RT- PCR鉴定。经1琼脂糖凝电泳检测扩增产物，部分扩增产物电泳结果见(图5)。 2.3 质粒的PCR鉴定小量提取质粒后乙脑引物鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测，可见大小为460bp左右的片段部分结果见(图6)，与预期结果相符。2.4 目的基因的测序结果将RT-PCR产物克隆到pMD18-T载体中进行序列测定：扩增的目的基因全长463bp经分子生物学鉴定，根据Chen等建立的乙脑病毒株C/PrM基因核苷酸序列基因分型法，确定本次实验得到的乙脑病毒为基因I型测序结果：ATGGTCGCTGCACACGGACCAGGCATTCCAAASBCTTGCGACAATCAAGAAGTCTACGTGCAGTATGGTCGCTGCACACGGACCAGGCATTCCAAAURYCGAAGCAGAAGATCCGTTTCAGTCCAAACGCATGGGGAAAGCTCACTAGTGAACAAAAAASBCTCGAAGCAGAAGATCCGTTTCAGTCCAAACGCATGGGGAAAGCTCACTAGTGAACAAAAAAURYGGGGCTTGGCTGGATTCGACGAAGGCCACGCGATACCTCATGAAAACGGAGAACTGGATCSBCTGAGGCTTGGCTGGATTCGACGAAGGCCACGCGATACCTCATGAAAACGGAGAACTGGATCURYATAAGGAACCCTGGTTATGCTTTCCTGGCGGCGGCACTTGGATGGATGCTTGGCAGCAACSBCTATAAGGAACCCTGGTTATGCTTTCCTGGCGGCGGCACTTGGATGGA3 小结成功扩增出乙脑片段，并构建了克隆测序质粒，经测序结果正确，为后期乙脑基因I型的研究奠定了基础。 第二章虫媒病毒的分子流行病学调查1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂经典总RNA提取试剂盒购自上海生工有限公司；DMEM细胞培养液、1640细胞培养液购自HyClone；血清购自长春博源公司；DL2000 Marker购自TaKaRa公司；其它试剂均为国产分析纯。1.1.2 主要仪器低温台式离心机购自Eppendoff公司； -40低温冰箱，购自海尔公司；PCR扩增仪购自PERKIN ELMER公司；CO2培养箱购自SANYO公司。1.2 方法1.2.1 引物设计根据文献报道的云南省曾经报导的虫媒病毒，利用DNAstar软件分别设计、基孔肯雅、辛德毕斯和盖塔引物，由上海生工合成。如下表所示：GeneSize of productsSequenceDescription盖他病毒1004 bp5-CGTGACACCAGAGGATGCCCAG-3Forward5-GCCTGATGCCTCCTCCTTCTTG-3Reverse基孔肯亚354 bp5-GCCCACACTGTGAGCGCGTAC-3 Forward5-TTCGGACTTCTCCACATGTGC-3Reverse辛德毕斯353bp5-GCCCCTTCCCCGCCCCCACAT-3Forward5-GCCTATCACTTCGCCTGCTTC-3ReversePCR的反应体系：模板5l，2Mix Buffer 12.5l， H2O 4.5 l，上游、下游引物各1l，总体系25l，。盖他病毒反应条件：94变性30s，60退火30s，72延伸30s，共35个循环，最后72延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳。基孔肯亚反应条件：反应条件：94变性30s，55退火30s，72延伸30s，共35个循环，最后72延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳。 辛德毕斯反应条件：94变性30s，58退火30s，72延伸30s，35个循环，最后72延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳。1.2.2 目的基因的克隆样品RT-PCR鉴定为阳性样品的经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的处片段并与pMD18-T载体连接。16孵育12h，转化DH5感受态；冰浴30min，42热激90s；冰浴8-10min，加入800L无抗性LB； 37摇床，240r /min，60 min；6000r/min离心1min，弃上清后，5 0L菌液吹打均匀后均匀涂布于含Amp抗性的LB平皿中；3712后挑取单个菌落。1.2.4 重组质粒的小量提取样品RT-PCR鉴定为阳性样品的经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的处片段并与pMD18-T载体连接。16孵育过夜，转化DH5感受态；冰浴30min，42热激90s；冰浴8-10min，加入800L无抗性LB； 37摇床，240r /min，60 min；6000r/min离心1min，弃上清后，5 0L菌液吹打均匀后均匀涂布于含Amp抗性的LB平皿中；3712后挑取单个菌落。1.2.5 疑似阳性测序 疑似阳性质粒进行序列测定，由上海生物工程公司完成。 2 结果2.1 蚊虫研磨样品RT- PCR鉴定结果研磨后提取的RNA反转录成cDNA为模板，进行RT- PCR鉴定。经1琼脂糖凝电泳检测扩增产物，盖塔病毒扩增产物电泳结果见(图1)，辛德毕斯病毒扩增产物电泳结果见(图2)，基孔肯雅病毒扩增产物电泳结果见(图3)。2.2 疑似阳性的测序结果将RT-PCR产物克隆到pMD18-T载体中进行序列测定，发现本次实验并未发现相应的虫媒病毒。3 小结本实验通过对蚊子样品进行虫媒病毒的分离，并未获得预期的结果，可能与采样主要为三带喙库蚊库蚊为主，虫媒病毒在较小地域分布不均有关，为以后探索虫媒病毒的分离奠定基础。 第三章 JEV 基因I型荧光定量PCR方法的建立1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病毒毒株 实验室分离到乙脑毒株，PRRSV等毒株为本实验室保存。1.1.2 主要试剂经典总RNA提取试剂盒，购自上海生工生物工有限公司；DNA小量凝胶回收试剂盒为Axygen；T4 DNA连接酶购自TaKaRa；反转录酶M-MLV及RNA 酶抑制剂均购自普洛麦格公司；其他化学试剂均为国产分析纯。1.1.3 主要仪器设备低温台式离心机，购于Eppendoff公司； ABI 7500型荧光定量PCR仪购自ABI公司；-80超低温冰箱，SANYO公司产品；NANODROP2000分光光度计；TanonGIS-2008凝胶成像系统购自上海天能公司； SYBR Green Real-time PCR Master Mix购自日本东洋纺。1.2 方法1.2.1 引物的设计与合成根据本实验室在云南地区分离的JEV的核苷酸序列，设计了针对E基因的Real-time PCR引物JEV YG1/JEV YG2(表1)。以上引物均由大连宝生物工程有限公司合成。引物名称Primer names引物序列Primers Sequences产物大小/bpProduction length位置GeneJEVYG1JEVYG25-GGCAAACGACAAACCAACATT-3 5-ATCAGCTCGCTTCTCGTTGTG-3160bpE1.2.2 乙脑RNA的提取提取乙脑病毒提取RNA按照上海生工总RNA提取试剂盒。用于标准质粒的构建和荧光定量PCR过程中的特异性检测。1.2.3 标准质粒的构建以提取的乙脑病毒总RNA反转录得到的cDNA为模板，以JEV E1/JEV E2为引物扩增乙脑病毒基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收处片段并与pMD18-T载体连接，16连接12h。转化DH5涂布于带有Amp抗生素(50ug/mL)的LB平板， 37培养12h。挑取单个转化菌落接种于含Amp LB液体培养基试管中，3712h。质粒的小量提取。测OD260nm/OD280nm 1.86。拷贝数计算公式：拷贝数(copies/mL)=质粒浓度(g/mL)阿弗加德罗常数/质粒分子质量；质粒分子质量一个碱基对的平均分子质量重组质粒碱基数。1.2.4实时荧光定量PCR方法的建立1.2.4.1最佳反应条件的优化 优化PCR扩增条件：退火温度、延伸温度、循环次数。在PCR扩增过程中，通过反复试验确定PCR的最佳反应条件95 30s ；60 30 s；40 Cycles。1.2.4.2标准曲线的建立 将标准质粒10倍系列稀释标准质粒7个梯度10-1 10-7 (2.61002.6106 copies/ul)。荧光定量完成后选取这些不同Ct值建立标准曲线。1.2.4.3重复性检验 在每次试验中对标准品每个稀释度都做3个重复孔，同时对样品重复三次，根据同一批次组内的差异性和不同批次组间的差异，判断该方法的重复性和稳定性。1.2.4.4 灵敏度检测 标准品用10倍系列稀释样度10-1 10-10 (11001106 copies/ul)，同时设置阴性对照进行Real-time PCR反应，以检测实时荧光定量PCR方法能够检出最低病毒含量。 1.2.4.5 特异性检测 在相同条件下对PRRSV、CSFV、SINV、PCV-2为模板进行特异性的检测，同时设置阴阳性对照，根据扩增曲线验证该方法的特异性。1.2.4.6 熔解曲线 以温度为横轴，以不同温度下荧光值的变化速率为纵轴，建立熔解曲线。2 结果2.1 标准质粒pMD18-T-JEV-E的PCR的扩增用JEV E1/JEV E2引物PCR扩增，结果与预期大小相一致(E基因目的条带为475bp，见图1)。2.2 标准质粒和乙脑病毒核酸浓度、纯度的测定经测定标准质粒pMD18-T-JEV-E的浓度为477ug/mL，OD260nm/OD280nm1.86，标准质粒pMD18-T-JEV-E的拷贝数=1.041014 copies/mL；乙脑病毒核酸浓度为36.54ug/mL，乙脑病毒核酸拷贝数=5.35109 copies/mL。5uL模板中含有乙脑病毒核酸2.7107 copies。2.3 Real-time PCR的标准曲线以10倍系列稀释的7个梯度(2.61002.6106 copies/ul)的标准质粒pMD18-T-JEV-E为模板进行Real-time PCR反应，选取至少5个Ct值和其标准品的拷贝数制作标准曲线。结果显示，标准曲线Ct值和标准DNA浓度间呈现良好的线性关系(见图16)。阴性对照没有出现特异性的扩增曲线。2.4 Real-time PCR的灵敏度分析 用10倍系列稀释样本核酸(2.71002.7106 copies/ul)，以该7个数量级梯度为模板进行Real-time PCR反应。结果显示，当样品中含有2.7101 copies cDNA时，用建立的Real-time PCR方法检测仍能产生很好的特异性扩增。阴性对照没有出现特异性扩增。2.5 Real-time PCR的重复性分析 以10倍系列稀释的7个梯度(2.61002.6106 copies/ul)的标准质粒pMD18-T-JEV为模板进行PCR扩增。结果表明，建立的Real-time PCR 在组间和组内都具有良好的重复性(P0.05)，相关系数大于0.99。阴性对照没有出现特异性扩增。阳性模板拷贝数同一批次3个重复的Ct值平均值标准差变异系数1232.610611.23711.16911.18811.1980.0350.3132.610514.24814.10014.13714.1610.0770.5432.610417.32717.24317.18917.2530.0690.4032.610320.40620.40019.97520.2600.2471.219阳性模板拷贝数不同批次3个重复的Ct值平均值标准差变异系数1232.610611.24611.08810.97511.1030.1361.2262.610514.22314.31713.98714.1750.1701.1992.610417.38317.26716.98817.2130.2031.1792.610320.50320.42220.37520.4330.0640.3162.6 Real-time PCR的特异性分析 用建立的Real-time PCR进行扩增反应验证特异性。结果发现， JEV出现特异性扩增，PCV-2、PRRSV、CSFV、SINV没有出现特异性扩增。2.7 熔解曲线分析本试验利用优化后Real-time PCR检测方法对标准质粒pMD18-T-JEV-E进行扩增，结果扩增产物均为单一峰，Tm 值均一，没有出现非特异性的扩增。3 小结 成功建立了JEV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。熔解曲线为单一峰型，灵敏度高，不出现非特异性的扩增。SYBR Green I荧光定量PCR方法相比传统PCR检测时间缩短一半。 讨 论1乙脑基因I型的分离和鉴定日本脑炎（JE）是日本脑炎病毒（JEV）引起的人畜共患的疾病。乙脑引起病毒性脑炎是亚洲最常见的脑炎疾病，从中国中俄边境地区到澳大利亚的北部，从东部的西太平洋岛屿到西部印巴边境地区都有JE的爆发，在19世纪末期日本报导，但1924日本首次证实乙脑病例报告，随后韩国（1933年），中国（1940年），菲律宾（1950年），印度（1955），和其他一些亚洲的国家陆续爆发，在过去的几十年里，乙脑发病率已经在一些国家（例如日本、中国、韩国和台湾），但也有些国家患病率有所增加（例如孟加拉国、柬埔寨、印度、印度尼西亚和巴基斯坦）。在上世纪90年代末，乙脑病毒开始在世界各地传播流行，如今，JE影响25个亚洲国家，大约60全球人口存在接触乙脑的风险。在农村地区，乙脑每年造成50000人-15000人死亡。目前有五个乙脑病毒的基因型。近年来，研究发现基因型I已经取代基因型III为主导乙脑病毒基因型和GV也再次出现后，这些情况严重威胁者公众健康。乙脑是蚊子传播的虫媒病毒，三带喙库蚊是主要的传播媒介。蚊子和其他昆虫在吸血过程中被感染，因而乙脑可以在他们的身体复制和感染其它的动物例如鸟类和猪。因此，乙脑自然周期蚊子-鸟或蚊子-猪。在热带和亚热带地区，蚊子可以一年四季不断繁殖，并由此连续蚊子和动物宿主之间发生连续传播。家畜感染和家禽在乙脑流行季节大多成为乙脑临时宿主和特别是，仔猪极易受到蚊子叮咬而感染。在据报道在1949年中国大陆的报道了第一个JE病，之后中国成为亚洲地区一个高度流行区，1971年报告了超过170000例。20世纪50年代以来，100余株乙脑病毒从不同的宿主分离到。因此JE是在中国法律上报告传染病。在20世纪70年代末开始接种乙脑疫苗成。随后，报告乙脑病例，发病率和死亡率逐渐下降。在20世纪90年代每年20000至40,000例。从2000年到2005年，报告的病例从11779下降到5097，发病率从0.9489/10万下降到0.3898/10万，死亡人数从375下降到214，死亡率从0.0302/10万下降至0.0164/10万，死亡率范围在2.51-4.66。2006年报告7643案件（463人死亡），而共报告2010共报告2541例（92人死亡）。近年来无论是数量病例和死亡的显著数量降低。中国有广阔的领土，乙脑病例在南部和北部中国不同显著。通常情况下，在中国南方的发病率七月和在八月底显著下降，而在中国北方发病率八月显著后增加在9月中旬减少。2006年至2010年，JE发病率和死亡率在六月后显著上升，在七月和八月达到高峰，而10月以后下降。虽然发病死亡出现下降，但其危害性依然严重。在1940年中国也分离到乙脑毒株，乙脑疫情爆发的省份中云南最多。为了研究云南省部分地区乙脑的发病及流行病学。本研究选取乙脑发病流行比较严重的云南省，在蚊子比较活跃的季节进行采样。采集的蚊子主要为三带喙库蚊。从本研究分离到的乙脑基因I型也可以得出乙脑病例出现与蚊虫活跃程度呈现一致性。2虫媒病毒的分子流行病学调查黄病毒属（黄病毒科，黄病毒），甲病毒属（披膜病毒科，属甲病毒）和布尼亚病毒属（布尼亚病毒科）是主要的虫媒病毒。虫媒病毒是吸血节