基因工程期末考试重点知识整理

基因工程 第一章 基因工程概述 1 基因工程的概念 基因工程基本技术路线 PPT 基因工程 Gene Engineering 是指在基因水平上的遗传工程 它是用人为方法将大分子 DNA 提取出来 在离体条件下用适当的工具酶进行切割后 把它与作为载体的 DNA 分子连 接起来 然后与载体一起导入某一更易生长 繁殖的受体细胞中 以让外源遗传物质在其中 安家落户 进行正常的复制和表达 从而获得新物种的一种崭新的育种技术 2 基因工程的历史 基因工程准备阶段 1972 第一个重组 DNA 分子的构建 构建人 Paul Berg 及其同事 PPT 基因工程诞生 1973 Cohen 2 加 200 l 新鲜配制的溶液 II 0 2mol L NaOH 1 SDS 缓和震荡 水浴 5min 3 加 150 l 预冷溶液 III 50mol L KAC 60ml 冰乙酸 11 5ml 水 28 5ml 缓和震荡 冰 浴 5min 4 4 以 12000g 离心 5min 将上清转移到另一离心管中 5 向上清中加入等体积酚 氯仿 1 1 反复混匀 12000rpm 离心 5min 将上清转至另 一离心管中 6 向上清加入 2 倍体积无水乙醇 混匀后室温放置 5 10min 12000rpm 离心 5min 弃上 清 吸干离心管中的液体 析出 DNA 7 用 1ml70 乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀 振荡并离心 倒去上清 自然干燥 洗出金属盐离 子 8 加 20 l TE 缓冲液 其中含有 20 g ml 的胰 RNA 酶 使 DNA 完全溶解 9 凝胶电泳检测抽提结果 剩下的 DNA 放 20 C 冰箱保存 19 凝胶电泳检测原理 种类 过程 注意事项 凝胶电泳的原理 当一种分子被置于电场中 它们就会以一定的速度移向适当的电极 这种分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率 它同电场的强度和电泳分子本 身携带的净电荷成正比 在电场中 DNA 带有负电荷 向正极泳动 在一定的电场中 DNA 分子的泳动速度取决于核酸分子本身的大小和构型 种类 琼脂糖凝胶电泳 凝胶浓度越大 孔隙越小 越适合小分子 DNA 结构 DNA 分 子量 V 共价闭环 V 线状 V 开环状 聚丙烯酰胺凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳 20 SDS PAGE 原理 各成分作用 原理 SDS PAGE 分离蛋白质和寡核苷酸 是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS 十二烷 基磺酸钠 SDS 能断裂分子内和分子间氢键 破坏蛋白质的二级和三级结构 强还原剂 巯基乙醇 二硫苏糖醇 能使半胱氨酸之间的二硫键断裂 蛋白质在一定浓度的含有强还 原剂的 SDS 溶液中 与 SDS 分子按比例结合 形成带负电荷的 SDS 蛋白质复合物 这种复 合物由于结合大量的 SDS 使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特 征的负离子团块 从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异 由于 SDS 与蛋 白质的结合是按重量成比例的 因此在进行电泳时 蛋白质分子的迁移速度取决于分子大 小 各成分作用 聚丙烯酰胺 丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体 其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否 与促凝剂及环境密切相关 制胶缓冲液 浓缩胶选择 pH6 7 分离胶选择 pH8 9 选择 tris HCl 系统 TEMED 与 AP 促凝作用 加速聚丙烯酰胺的凝固 十二烷基磺酸钠 SDS 阳离子去污剂 作用有四 去蛋白质电荷 解离蛋白质之间的氢 键 取消蛋白分子内的疏水作用 去多肽折叠 21 PAGE 与琼脂糖凝胶电泳的区别 书本 p102 103 检测大小 PAGE 分辨率更高 支架 琼脂糖 丙烯酰胺聚合 隔绝空气 垂直结构 加促凝剂 垂直与水平结构 百度完善 22 分子杂交种类 原理 过程 Southern 杂交 Southern 印迹杂交由 E Southern 于 1977 年建立 它根据毛细管作用原理 使在电泳凝 胶中分离的 DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上 然后通过与已标记的单链 DNA 或 RNA 探 针的杂交作用以检测这些被转移的 DNA 片段 过程 1 酶切 2 电泳 照相 3 变性 中和 变性试剂 0 4M NaOH 中和试剂 0 5M NaOH 1 5M NaCl 或 1M Tris pH7 4 1 5M NaCl 4 转移 转移方式 毛细管 电 转移 真空 转移 buffer 6 SSC 或 SSPE 5 固定 80 2hr 或者 UV 照射 microwave Northern 杂交 主要针对 RNA 分子的检测 基本步骤与 Southern 印迹杂交相似 变性试剂不同等 见作业 百度 Western 杂交 转移的是蛋白质而不是 RNA 菌落杂交 菌落原位杂交 其他分子杂交 p109 噬菌斑杂交 书本 p109 斑点杂交 斑点印迹杂交 将通过特殊的加样装置将变性的 DNA 或 RNA 核酸样品 直接 转移到适当的杂交滤膜上 然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异 性 DNA 或 RNA 狭线杂交 23 探针种类 同源或部分同源探针 总 cDNA 探针 特异性 cDNA 探针 人工合成的寡核苷酸探针 24 E coli 感受态细胞制备过程 PPT 25 DNA 导入大肠杆菌的方法 影响转化的因素 DNA 分子导入大肠杆菌主要通过转化来完成 噬菌体和 M13 噬菌体感染宿主细胞时分别 涉及转导和转染过程 转导 感受态细胞 CaCL2 转化法 电转化法 转染 采用与质粒 DNA 转化受体细胞相似的方法 将重组 噬菌体 DNA 分子导入受体细胞 的过程 转导 通过 噬菌体 病毒 颗粒感染宿主细胞的途径把外源 DNA 分子转移到受体细胞内 的过程 26 重组 DNA 分子导入真核细胞的方法 电穿孔法 基因枪法 显微注射法 脂质体介导法 花粉管通道法 农杆菌介导 27 重组子的筛选方法 一 遗传表型直接筛选法 1 根据载体选择标记初步筛选转化子 抗药性筛选 插入失活筛选法 插入表达筛选法 显色互补筛选法 2 营养缺陷型检测法 根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质 筛选含目的基因的克隆子 若目的基因 产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记或基因产物与某些药物作用是颜色反应 则可 根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子 该方法的使用前提是待选择的目的基因能 在受体菌中进行表达 3 形成噬菌斑筛选法 DNA 载体被外源 DNA 分子插入后 重组 DNA 分子大小必须在野生型 DNA 长度的 75 105 范围内 才能在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒 转导受体菌后 转化子在 培养基平板上被裂解形成噬菌斑 而非转化子正常生长 噬菌斑中的 噬菌体即为重组子 二 依赖重组子结构特征分析的筛选法 1 快速裂解菌落鉴定分子大小 质粒快检 此法主要是根据有外源 DNA 片段插入的重组质粒与载体 DNA 之间大小 差异来区分重组子 和非重组子 2 限制性核酸内切酶酶解分析法 通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法虽可初步筛选到重组子菌落 但却难以将其中 的期望重组子和非期望重组子区分开 因为重组质粒 DNA 中 质粒载体可能会与一个以上 的外源 DNA 片段连接重组 而采用限制性核酸内切酶分析法不仅可进一步筛选鉴定重组子 而且能判断外源 DNA 的插入方向及分子质量大小等 3 利用 PCR 方法筛选重组子 载体 DNA 分子中 外源 DNA 插入位点的两侧序列多为固定已知 通过与插入位点两侧 已知序列互补的引物 以从初选出来的阳性克隆中提取的少量质粒 DNA 为模板进行 PCR 反 应 通过对 PCR 产物的电泳分析就能确定是否是重组子菌落 28 RNAi 的概念和作用机制 RNA 干扰 RNAi RNA interference 是由双链 RNA 分子在 mRNA 水平阻断相应基因表达或使其沉默 的过程 它广泛存在于生物界 是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵而保持自身遗传稳 定的保护性机制 目前在果蝇 真菌 昆虫 植物以及哺乳动物中均有发现 RNAi 作用机制 长链 dsRNA 被切割成 20 25nt 长度的片段 即 siRNA siRNA 与核酸诱导 的沉默复合物 RISC 结合 作为模板识别目的 mRNA 通过碱基互补配对原则 mRNA 与 siRNA 中的反义链结合 置换出正义链 双链 mRNA 被相关酶切割产生 22nt 左右的 siRNA 后者与 RISC 结合 继续反复切割 mRNA 从而使基因沉默 29 miRNA 的概念和作用机制 Small RNAs 主要包括两大类 miRNAs microRNAs siRNAs short interfering RNAs miRNAs 普遍存在于动植物体内 影响基因表达 细胞周期调控和个体发育 它由非编码基 因转录物形成的茎环结构加工而来 长度 22nt 左右 成熟 miRNA 的 5 端为磷酸基团 3 端为羟基 表达具有严格的时序性和组织特异性 无 ORF 多存于间隔区 进化中结构高度保守 第八章 PCR 技术及应用 30 PCR 的概念 基本要素 具体步骤 反应体系 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 是指通过模拟体内 DNA 复制的方式 在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术 它包括变性 退火 延伸三个步 骤 基本要素 引物 dNTP 耐热 DNA 聚合酶 模板 DNA 具体步骤 变性 denaturation 90 98 退火 annealing 37 72 延伸 extension 72 PCR 反应体系 脱氧核苷三磷酸 dNTP dATP dGTP dCTP dTTP 是 PCR 的原材料 通过 PCR 过程聚合成互补链 DNA 贮存浓度 2 5mM 使用浓度 200 M 使用浓度不当会 影响扩增的产量 特异性和保真度 缓冲液 buffer TAE TBE TPE T Tris E EDTA A 乙酸 B 硼酸 P 磷酸 PCR 标准缓冲液含 10mmol L Tris HCL PH8 3 9 0 作用 缓冲 PH 提供部分反映成分 引物 primer 最佳引物使用浓度为 0 1 M 1 0 M 之间 引物浓度太低 扩增产 物太少 引物浓度太高 易出现非特异性扩增反应 引物长度 20nt 时 Tm 4 G C 2 A T 引物设计要求 设计的引物的核苷酸序列必须与模板链 3 端的一段核苷酸序列互补 且 3 端必 须有游离的 OH 基团 从 3 端开始接合模板链 PPT 上思考题选 A D 引物一般由 20 30 个核苷酸组成 4 种核苷酸尽可能随机分布 GC 含量应达 40 60 引物中应尽量避免回纹序列出现 引物中最好含有进一步操作中可利用的限制性核酸内切酶识别序列 模板 DNA 作为 PCR 的靶 DNA 一般是一个待扩增的特定双链 DNA 片段 应知道其两端 20 30bp 的核苷酸序列 供设计一对引物之用 PCR 的模板是一条单链 DNA 片段 其 3 端 具有与引物杂交的序列 耐高温 DNA 聚合酶 31 耐高温 DNA 聚合酶的种类 各自的特点 Taq DNA 聚合酶 来自嗜热古细菌 Thermus aquaticus 该菌 1967 年从温泉中分离 最 适生长温度 70 现市场上销售的是该基因在 E coli 细胞中的表达产物 特征 相对分子质量为 94 103 为单分子酶 具较强的 5 3 DNA 聚合酶活性和较弱 的 5 3 外切酶活性 缺乏 3 5 外切酶活性 最适 pH9 0 最适反应温度 75 合成出错几率 8 9 10 5 1 1 10 4 Pwo DNA 聚合酶 来自喜温性古细菌 Pyrococcus woesei 现市场上销售的是该基因在 E coli 细胞中的表达 产物 特征 相对分子质量为 90 103 具较强的 5 3 DNA 聚合酶活性 兼 3 5 外切酶 活性 耐热性更高 保真度比 TaqDNA 聚合酶高 10 倍 Tth DNA 聚合酶 来自喜温性真细菌 Thermus thermophilus HB8 具较强的 5 3 DNA 聚合酶活性 缺乏 3 5 外切酶活性 最适 pH9 0 最适反应温度 75 Mg2 存在时 以 DNA 为模板合 成 DNA Mn2 存在时 可以 RNA 为模板合成 cDNA 用于 RT PCR 系统 Vent DNA 聚合酶 来自嗜热高温球菌 Thermococcus litoralis 相对分子质量 85 103 100 时该酶半衰 期为 1 8hr 具有 3 5 外切酶校对活性 合成的准确度比用 Taq DNA 聚合酶高 5 15 倍 Pfu DNA 聚合酶 来自激烈热球菌 Pyrococcus fariosus 保真度较高 3 5 外切酶活性 目前错配率 最低 KOD DNA 聚合酶 特征 具有强力的 3 5 核酸外切酶活性 与 Taq DNA 聚合酶相比 保真度比后者高 50 倍左右 合成速度比 Taq DNA 聚合酶快 2 倍 比 Pfu DNA 聚合酶快 6 倍 耐热性比 Taq DNA 聚合酶好 在 100 1 小时的热处理后仍可保持约 70 的活性 故根据需要可以 将热变性步骤的温度设定值提得更高 这对处理 GC 含量高的模板等具有特异性高级结构的 样品非常有利 高保真 DNA 聚合酶 Phusion 高保真 DNA 聚合酶 Finnzymes Phusion 采用一种新的蛋白融合技术 与一种 独特的双链 DNA 结合蛋白融合后 可以和模板更加紧密的结合 触发更为强劲和快速的扩 增 它甚至可以用于结合那些最难被结合的模板 持续扩增能力 processivity 决定最 大扩增长度 是 Pfu 酶的 10 倍 Taq 酶的 2 倍 商用混合 DNA 聚合酶 Ex Taq DNA 聚合酶 Ex Taq Hot start DNA 聚合酶 LA Taq DNA 聚合酶 LA Taq Hot start DNA 聚合酶 为了提高扩增的保真度或扩增较长 DNA 片段 将 Taq DNA 聚合酶的强启动能力和具有 3 5 外切酶活性高温 DNA 聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来 可以达到很好的效果 32 PCR 平台期的概念 出现平台期的原因 平台期 出现平台期的原因可能有 后期循环酶浓度或聚合时间不足 引物耗尽 dNTP 耗尽 产物浓度过高 以致 dsDNA 解链后又迅速退火 不能与引物结合 33 PCR 产物克隆的几种方式 在 PCR 产物两端添加限制性酶切位点 A T 克隆法 平末端 DNA 片段的克隆 长 片段 DNA 的 PCR 扩增 34 PCR 扩增未知片段的几种方式 反向 PCR 利用接头的 PCR 热不对称交错 PCR 35 RACE DD PCR RAPD AFLP 的概念 原理 参见 PPT 第九章 DNA 序列分析 36 两种不同的测序方法的基本原理 Maxam Gilbert 化学降解法 将待测 DNA 片段的 5 端磷酸基团作放射性标记 再分别采用不同的化学方法对特定碱基 进行化学修饰并在该位置打断核酸链 从而产生一系列 5 端被标记的长度不一且分别以 不同碱基结尾的 DNA 片段 这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样的方式用凝胶电泳 进行分离 再经放射自显影 即可读出目的 DNA 的碱基序列 Sanger 双脱氧链终止法 双脱氧核苷酸 ddNTP 分子的脱氧核糖的 3 位置的羟基缺失 当它与正常核苷酸混合在 同一个扩增反应体系中时 在 DNA 聚合酶的作用下 虽然它也能参与 DNA 合成 但由于其 3 位置的羟基缺失 使其下面的核苷酸的 5 磷酸基无法与之结合 也就是说 一旦双脱 氧核苷酸整和到正在合成的 DNA 链中 该股 DNA 的合成就到此终止 37 序列分析的基本步骤 1 模板制备和引物设计 模板 单链或双链 DNA 必须保证足够的浓度 引物 18 22nt 55 60 尽量避免 3 个以上碱基重复 尽量减少发夹结构形成的可能性 2 经典测序方法的反应步骤 模板变性 退火 标记 掺入标记 32P dATP 33P dATP 35P dATP 末端标记 32P rATP 延伸 电泳分析和数据读取 38 大片段 DNA 序列测定的方法 通用引物指导未知序列的测定 引物步移 随机克隆测序 缺失克隆测序 第十章 DNA 诱变 39 定向进化的概念 对于某些实验目的 一次突变很难获得满意的结果 通常采用反复多次诱变和循环 其目 的是获得满足人们需要的性能改良的蛋白质 又称为试管进化 40 随机诱变的方法 原理 1 错误掺入突变 在体外 DNA 扩增中 使用具有错配倾向的 DNA 聚合酶以及反应条件 使 碱基错误掺入到新合成的基因中 又称易错 PCR error prone PCR 热稳定 TaqDNA 聚合 酶和突变 DNA 聚合酶 error prone PCR 的实质 通过改变 PCR 反应条件来调整 PCR 反应中突变的频率 降低聚 合酶固有的突变序列倾向性 提高突变谱的多样性 使得错误碱基随机地以一定的频率掺 入到扩增的基因中 从而得到随机突变的 DNA 群体 最后用合适的载体克隆突变基因 2 盒式诱变 盒式取代诱变 简单的盒式取代诱变是通过限制性酶切除去特定的双链 DNA 片段 再与 含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接 得到取代突变 是一种定点诱变 混合寡核苷酸诱变 若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸 则可在限定区 域内引入大量的随机突变 3 增变菌株的诱变作用 概念 与 DNA 错配校正功能和 DNA 损伤修复有关的基因突变后 细胞内基因的突变频率大 大增加 这样的菌株叫增变菌株 mutator strain 常用增变菌株 E coli XL1 Red mutD mutS mutT mutD 突变造成 DNA 聚合酶 的 3 5 外切核酸酶活性缺陷 失去错配碱基的校正功能 mutS 突变使 DNA 错配修复系统失去功能 mutT 突变不能水解 dGTP 的氧化产物 8 oxodGTP 8 羟基鸟嘌呤在复制时掺入 DNA 中 造 成突变 4 化学诱变 用化学诱变剂处理双链 DNA 片段 将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中 构建 成一个重组突变体库 用适当的功能分析可鉴别携带突变的重组子 41 体外重组的种类 概念 特点 DNA 洗牌法 DNA shuffling 是通过对一组序列相关 DNA 序列 经过超声波处理或在 DNaseI 的作用下随机切成小片段 然后在没有引物的情况下 采用有性 PCR 方法进行合成 随着循环数的增加 PCR 产物将越来越接近切割前的目的基因的长度 最后用基因两侧的 引物合成全长的基因 筛选瓶颈 有性 PCR DNA shuffling 技术的优点 可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组 体与突变序列 从而大大加快进化速度 而且对可操作的靶序列没有任何要求 长度可达 几十 kb 通过多轮筛选或选择 可以使有益突变迅速积累 导致功能的明显提高 从 表型上早期进行选择 而不必了解 DNA 片段上序列的信息 简化了操作程序 比随机突 变显著提高了良性突变的概率 交错延伸重组 交错延伸重组是一种简化的 DNA shuffling 技术 它不是由短片段组装全长基因 而是在 PCR 样反应中将含不同点突变的模板混合 随之进行多轮变性 短暂 5sec 复性 延伸反 应 在每一轮 PCR 循环中 那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继 续延伸 由于模板转换而实现不同模板间的重组 这样重复直到获得全长基因片段 重组 的程度可通过调整反应时间和温度来控制 控制温度 退火 延伸时间 随机引发重组 RPR 以单链 DNA 为模板 配合一套随机序列引物 先产生大量互补于模板不同位点的短 DNA 片段 由于碱基的错配和错误引发 这些短 DNA 片段中也会有少量的点突变 在随后的 PCR 反应中 它们互为引物进行合成 伴随组合 再组装成完整的基因长度 该法可以用一条 DNA 单链为模板 因此可以直接以 cDNA 为模板进行随机引发重组 42 传统的定点诱变的方法 原理 Kunkel 定点诱变法 又称 U 法 参见 PPT 原理 dut dUTP 酶 dUTPase 缺陷 细胞不能把 dUTP 转化为 dUMP 因此细胞内 dUTP 的含量大为增加 其中一些 dUTP 可掺入 DNA 中正常情况下由 T 占据的位置 ung UDG 酶缺陷 UDG 酶 尿嘧啶 N 糖基化酶 可除去掺入 DNA 中的尿嘧啶残基 在体外用诱变引物合成的杂合双链 DNA 在导入正常 ung dut 菌株后 只有带有突变位点 的新合成链和作模板进一步复制 而野生型不能复制 这样能够生长的细胞就带有突变位 点 插入 M13 的 DNA 可以分别回收到两种形式 dsDNA 和 ssDNA 位点选择诱变 参见课本 P179 位点选择诱变法使用了 2 个寡核苷酸引物 一个是用来引入突变的引物 另一个是用来选 择用的 选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因 同时可用来选择引入突变的 DNA 链 特点 可正向选择突变链 使用高保真的 T4DNA 聚合酶合成 DNA 可以使用双良 DNA 作模 板 可进行多轮筛选 但需特定载体 即含有一个有缺陷的抗生素抗性基因 转化子诱变 参见课本 180 转化子诱变也使用了 2 个寡核苷酸引物 除了突变引物外 还使用了 1 个用来剔除单一酶 切位点的引物 因此该方法也称酶切位点剔除法 将待突变的 DNA 片段装载到克隆载体上 该载体上必须存在 1 个单一酶切位点 当这两个引物同时指导 DNA 合成时 突变的 DNA 链 将不再含有该单一酶切位点 而模板 DNA 在该位置能被切割 通过转化大肠杆菌 线性化 的模板 DNA 不能复制 只有突变保持环状 可以获得转化子 43 PCR 介导的定点诱变的方法 原理 大引物 PCR 诱变 重叠延伸 PCR 诱变 重叠延伸剪接技术 同源重组法 双向 PCR 快速定 点诱变 44 PCR 介导的定点诱变方法中 模板 DNA 的排除方法 限制性内切酶 DpnI 可特异性切割 dsDNA 中的 Gm6ATC 位点 对半甲基化的 DNA 效率较低 完全不能切割非甲基化 DNA 大肠杆菌体内 DNA 在 Dam 甲基化酶催化下完全甲基化 对 DpnI 敏感 用 4 种通用 dNTP 在体外合成的 DNA 没有甲基化 可以抵抗 DpnI 的切割 第十章 DNA 文库的构建和目的基因的筛选 45 基因组 DNA 文库 cDNA 文库的概念 基因组 DNA 文库 将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长 度范围的 DNA 片段 再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌 落 cDNA 文库 针对真核生物 若这些阳性菌落中所含的外源 DNA 不是基因组 DNA 而是由 某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经反转录形成的 cDNA 则称之为 cDNA 文库 cDNA 不含内含子 46 构建基因文库的基本程序 提取研究对象基因组 DNA 制备合适大小的 DNA 片段 或提取组织或器官的 mRNA 并反转录 成 cDNA DNA 片段或 cDNA 与经特殊处理的载体连接形成重组 DNA 重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌 阳性重组菌落或噬菌斑的选择 47 鸟枪法的概念 质粒文库 鸟枪法 霰弹法 利用机械剪切力和超声波等物理方法或限制性核酸内切酶酶切等生化 方法将生物 chr 打断 随后通过 T4 DNA 连接酶把这些片段与适当的质粒载体进行重组 转化受体菌后进行无性繁殖 获得一大群含不同外源 DNA 片段的克隆 再用简便的筛选方 法从众多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株 从中获得所要的基因 48 文库的代表性和随机性的意义 代表性 指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组 即可以 从该文库中分离任何一段 DNA 代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标 完整的基因文库所需克隆的计算公式 PPT 49 基因组 DNA 文库的构建流程及注意事项 1 基因组 DNA 文库的载体制备 载体的制备要求 纯度高 去磷酸化好 2 高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切 提取的基因组 DNA 要求保存完整 分子量越大 所得到的重组克隆的插入片段越大 3 文库的连接转化或包装侵染 在电转化和包装侵染过程中 首先选择转化效率高的感受态细胞或效价高且质量 稳定的包装蛋白 同时 研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率 另 外 对于电转化而言 选择合适的转化电压对不同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同 4 文库的质量检测 文库的平均插入片段长度是通过 PFGE 电泳检测一定数目的重组子的插入片段大 小所得平均值 美国的研究机构对 BAC 文库 一般要求植物的在 130kb 左右 而动物的 在 150kb 左右 插入效率 有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例 基因组覆盖倍数 平均插入片段长度 克隆数 基因组 DNA 的长度 一般是约数 基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围 检测时是通过选择一定数目的已知的 单拷贝的基因作探针来筛选文库 由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对 该基因位点的覆盖倍数 因此 基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数 使用的总探针数的比值 50 cDNA 文库的构建步骤 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离 第一链 cDNA 合成 第二链 cDNA 合成 双链 cDNA 克 隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖 双链 cDNA 文库非自然存在 病毒中逆转录成单 链 DNA 51 cDNA 第一 第二链的合成方法 第二条链 自身引导法 置换合成法 引导合成法 引物 衔接头合成法 52 文库中目的基因的筛选方法 表型筛选法 杂交筛选 差别杂交 mRNA 减法杂交 抑制性差减杂交 免疫筛选 高表 达基因 mRNA 差别显示 酵母双杂交系统 53 酵母双杂交的作用原理 参见 PPT 酵母双杂交原理 利用融合蛋白的策略 将蛋白 X 与 BD 融合 蛋白 Y 与 AD 融合 将它们 导入酵母细胞中共表达 如果 X 和 Y 相互作用 则会导致 BD 与 AD 在空间上接近 形成一 个有功能的转录激活因子激活下游报告基因的表达 一 名词解释 5 6 二 填空 1 28 三 问答 6 5 四 实验设计 12 1 现已知某环境中有一种能产生淀粉酶的细菌 请设计一合理实验 获得该细菌中的淀粉 酶基因序列并列出其在大肠杆菌中表达的实验步骤 2 试设计一合理实验 对克隆于载体 pBR322 中的四环素抗性基因 TetR 内的特定位置 碱基序列进行缺失突变 以获得预期的缺失突变体 一 概念 Sanger 测序法 化解降解测序法 基因组 DNA 文库 cDNA 文库 PCR A T 克隆 穿梭 载体 人工染色体 蓝白斑筛选 互补 限制性内切酶 包涵体蛋白 RNAi 次生菌 落 Kunkel 定点诱变法 Northern 杂交 PCR 平台效应 RACE 噬菌体载体 表达载体 酵母双杂交系统 1 目前实验室 PCR 常用的 DNA 聚合酶有哪些 列出各自的特点 2 列出琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺电泳的异同点 3 请列出五种实验室常用的分子克隆工具酶 并分别说明各自的用途 4 描述大肠杆菌体内 DNA 复制与 PCR 过程的异同点